介绍一篇发表在Nature Chemical Biology上的文章,题目为“Extensive protein pyrophosphorylation revealed in human cell lines”,通讯作者是来自德国洪堡大学的Dorothea Fiedler 教授,课题组的主要研究为包括磷酸化在信号通路以及代谢网络中的生物学功能。
焦磷酸化是一种新型的翻译后修饰,其形成过程主要分为两步:激酶催化Ser上形成磷酸化修饰(pSer);之后,在Mg2+存在下,高能的焦磷酸肌醇信使(PP-InsP)将β-磷酸基团转移到pSer上,这一步反应一般认为是非酶促的。目前针对焦磷酸化修饰的研究方法存在通量低、位点难以确定等问题,所以作者希望发展一种检测内源性焦磷酸化修饰的蛋白质组学方法。此前,作者建立了一种针对焦磷酸化肽的质谱检测方法,即肽段在CID碎裂模式下会产生特征的-178 Da的中性丢失,对应于焦磷酸(H4P2O7)的丢失。通过这一特征筛选出候选的母离子,再进行MS2检测。在本文的工作中,作者沿用了这一策略,并针对哺乳细胞设计了工作流程:蛋白质组样品首先经Trypsin酶解为肽段;为了减少磷酸化肽在后续富集时与焦磷酸化肽的竞争,再用λ-磷酸酶处理肽段样品,焦磷酸化修饰相对较难水解而得以保留;经固定化金属离子亲和层析(SIMAC)富集后,通过UPLC进一步除去含有多个单磷酸化位点的肽段;最后,加入柠檬酸钠除去Fe3+与焦磷酸肽的加合物,样品进行LC/MS-MS分析。在数据分析过程中,由于双磷酸肽与焦磷酸肽可能发生共流出和共碎裂,故需要排除混合有双磷酸肽的情况。为此,作者设计了三步筛选步骤:一是-178 Da中性丢失峰的强度排在前三;二是手动检查MS2中是否存在单个磷酸化的肽片段,并舍去;三是舍去缺少关键焦磷酸化残基片段的谱图。之后,作者通过该流程,在HEK293T以及HCT116两种人源细胞系中共鉴定到71种蛋白质上的148个焦磷酸化位点,其中145个为Ser,3个为Thr。共有序列的分析显示,这些位点大多数位于强酸性区域,附近有较多的Asp和Glu残基。GO分析显示,焦磷酸化的蛋白可能在细胞核及核仁加工过程中发挥生物学功能,主要包括RNA剪接和核糖体的生物合成。之后,作者对焦磷酸化修饰的生物学功能进行了简单的验证。NOLC1、TCOF1是在本研究中发现的焦磷酸化程度最高的两种蛋白质,分别具有34、18个焦磷酸化位点。此前的研究表明,这两种蛋白可以通过结合RNA聚合酶Ⅰ上调rRNA合成,作者猜想焦磷酸化修饰可能会影响这一过程。他们首先证实5PP-InsP5是焦磷酸化修饰形成过程中主要的磷酸基团供体。在敲除了5PP-InsP5的合成酶IP6K后,蛋白质的焦磷酸化水平下降,45S rRNA前体的转录水平下降,而在WT细胞中加入IP6K的抑制剂TNP或SC-919具有类似的作用效果,证实5PP-InsP5在rDNA转录过程中发挥了重要作用,有可能是通过对关键的核仁蛋白进行焦磷酸化实现的。总之,作者发展了一种检测内源性焦磷酸化修饰的蛋白质组学方法。原文链接:https://www.nature.com/articles/s41589-024-01613-5文章引用:https://doi.org/10.1038/s41589-024-01613-5
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