分享一篇发表在Cell Research上的文章Accurate de novo design of heterochiral protein–protein interactions，通讯作者是来自西湖大学的卢培龙研究员和清华大学的刘磊教授，他们的主要研究方向分别是蛋白质设计和蛋白质化学合成。D-蛋白是由D-氨基酸和非手性氨基酸如甘氨酸组成的蛋白，其可以与天然的L-蛋白靶标形成特定的异手性蛋白-蛋白质相互作用(PPIs)，具有高度的生物正交性和稳定性。为了识别结合L-蛋白靶标的D-蛋白分子，已经开发了镜像噬菌体展示技术，然而展示技术无法靶向靶标蛋白的特定表位，且无法确认初始随机库中是否存在足够有效的结合剂。与传统的筛选方法相比，计算设计提供了一种靶向特定表位的策略，已经报导了若干设计L-蛋白以结合天然蛋白的例子。然而，PDB中只包含很少的D-蛋白与L-蛋白之间异手性相互作用的结构，这为设计D-蛋白结合剂带来了挑战。现有的设计D-蛋白结合剂的案例依赖于从靶蛋白结合的L-构型α-螺旋中获得结构信息，且只局限于单螺旋支架。针对任意靶标蛋白特定表面区域，且仅从靶标蛋白结构开始设计D-蛋白结合剂仍然是尚未解决的问题。本文作者希望开发一种整合计算设计和实验筛选的方法，以设计D-蛋白结合剂。该方法首先在镜像空间中针对反转的D-靶标进行设计，随后化学合成D-靶标以实现L-结合剂的酵母展示筛选，最后将筛选得到的L-结合剂重新合成为D-结合剂以靶向天然的L-靶标。在设计阶段，作者假设异手性PPIs与天然PPIs之间遵循相同的物理化学原理，通过化学和形状上的互补性来优化相互作用界面。作者首先使用Rosetta计算了PDB中异手性PPIs复合物的结合能和界面指标，发现计算值与L-型PPIs的相似，表明这些指标可用于D-结合剂的计算设计和筛选。随后，作者反转L-蛋白靶标生成D-型结构，使用RifDock将离散的L-氨基酸对接至D-靶标的选定表面，以生成旋转异构体相互作用场(RIF)。在RIF的指导下，将9606个L-构型迷你蛋白支架对接至D-蛋白靶标，最后进行主链采样和界面设计以优化结合。作者选择了一种人工α-螺旋肽L-Pep-1和两种具有药理学意义的天然L-蛋白，原肌球蛋白受体激酶A的D5结构域(L-TrkA)和人白细胞介素6(L-IL-6)。作者化学合成了毫克级上述蛋白的D-型镜像，针对已知的相互作用表面分别设计了7703/13158/4642种L-结合剂，长度在50-65AA。通过酵母表面展示技术和2~4轮FACS分选进行富集，top1富集被表达纯化，通过生物层干涉法测量的亲和力分别为22nM、152nM和25nM。随后还可通过定向进化进一步优化亲和力，通过饱和突变、组合突变等策略，最终得到的L-57445-evoD-TrkA和L-25367-evoD-IL-6分别对其靶标具有7.8nM和0.7nM的亲和力。最后，作者重新化学合成了L-结合剂的D-镜像，发现这些D-结合剂具有非常高的热稳定性和抗蛋白酶解能力，且对天然L-靶标的亲和力与镜像条件下测得的值相似。在基于细胞的实验中，D-57445-evoL-TrkA和D-25367-evoL-IL-6能够通过竞争靶蛋白的天然配体来有效阻断下游信号通路。D-19437L-Pep-1与L-Pep-1的晶体结构也与设计模型高度相似。总之，本文作者首次展示了异手性蛋白质相互作用的精确从头设计，结合化学合成以进行高通量表征，并揭示了异手性相互作用与同手性相互作用在结构上的相似性和差异性。这些镜像结合剂的设计有助于新的治疗和诊断方法开发，并促进镜像生物学的发展。本文作者：WFZ责任编辑：ZF原文链接：https://www.nature.com/articles/s41422-024-01014-2文章引用：DOI：10.1038/s41422-024-01014-2
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