分享一篇近期发表在Biomacromolecules上的文章，题目为Facile Preparation of Heteropolypeptides from Crude Mixtures of α‑Amino Acid N‑Carboxyanhydrides。文章的通讯作者是来自苏州大学的宋子元教授。
从氨基酸-N-羧基内酸酐（NCA）的开环聚合（ROP）获得的合成聚多肽是一类重要的生物材料，在药物载体、组织工程材料和抗菌聚合物等领域具有广泛的应用。具有两种或多种侧链的杂聚多肽可以调控聚多肽材料的性能，具有巨大的应用潜力。杂聚多肽通常是由多种NCA单体的直接聚合或均聚多肽前体的聚合后修饰进行制备，但直接聚合所需的NCA单体必须单独合成和纯化（即单独光气化），增加了时间和成本。从多种氨基酸一锅制备NCA混合物并聚合得到杂聚多肽（即一锅光气化）将极大地简化杂聚多肽的合成，但是两种或两种以上氨基酸的光气化通常会得到含有大量杂质的油状NCA混合物，导致NCA混合物的直接聚合仍然具有挑战性。
本文中，作者开发了一种从粗NCA混合物中制备杂聚多肽的简便方法（图1）。通过多种氨基酸的一锅光气化，并结合正己烷的沉淀过程和有机/水双相体系的分离过程，作者从粗NCA混合物中有效地去除了大部分杂质，并合成了具有不同组成的杂聚多肽。这种方法具有总收率高、快速和简便等优势。
图1. 单独光气化策略和一锅光气化策略制备杂聚多肽 首先，作者通过γ-苄基-L-谷氨酸（BLG）和Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸（ZLL）的一锅光气化得到了呈淡黄色油状的NCA二元混合物，并尝试在DCM/水双相体系中聚合，但聚合非常缓慢，且GPC显示所得杂聚多肽具有双峰分布，表明在双相分离之后仍然存在杂质（图2a-c）。而BLG和ZLL的单独光气化生成的粗NCA为白色固体粉末，当以1:1的摩尔比混合时，在双相体系中成功共聚（图2b、c）。基于上述结果，作者认为光气化策略在控制杂质含量方面发挥了重要作用（图2d）。由于BLG-NCA和ZLL-NCA具有高结晶度，在分别合成时，大部分挥发性杂质（即HCl和光气）在真空条件下从NCA固体粉末中蒸发掉。但是在两种或两种以上NCA单体存在的情况下，结晶较为困难，与单独的光气化策略相比，会有更多的杂质残留在油状混合物中。 杂质的定量分析对粗NCA混合物的聚合行为至关重要，而通常采用的氯含量分析较为繁琐，因此作者尝试开发一种简便的方法来量化粗NCA混合物中的杂质。他们发现杂质（即HCl和光气）会显著降低水溶液pH值，而NCA缓慢水解成氨基酸，形成两性离子，不会显著改变水溶液pH值（图3a），因此可以利用它们不同的水解行为来区分NCA和杂质。为了验证这一假设，作者将HCl、三光气和纯化的BLG-NCA分别溶解在pH = 4.3的二氧六环/水缓冲液中，并监测pH的变化。结果显示加入HCl和光气后pH迅速降低，而加入BLG-NCA后pH在前10分钟的变化可以忽略不计（图3b）。因此，可以通过定量计算酸性物质的含量来量化粗NCA混合物中的杂质。采用新的定量方法，作者比较了不同制备策略下BLG-NCA和ZLL-NCA粗二元混合物中的杂质含量。采用一锅光气化策略的粗NCA混合物的杂质含量是单独光气化策略下的2.5倍（图3c）。此外，克级合成的粗NCA也会比毫克级合成产生更多的杂质（图3d），这主要是由于从大量油状混合物中蒸发杂质的难度增加。 为了在原位双相分离策略的基础上进一步去除杂质，作者研究了不同纯化方法的效率（图4）。他们发现加入额外的水洗步骤并没有显著降低杂质含量。他们还尝试采用正己烷沉淀的方法去除不溶于水的杂质，发现单独的沉淀法不如双相分离法有效，但二者的结合可以去除90%的杂质。因此，同时采用沉淀策略和双相分离策略可以有效地纯化NCA粗混合物。 在之前的报道中，作者发现在聚合体系中加入DMF可以改善聚合物的分子量分布，因此作者采用添加DMF的双相体系制备杂聚多肽。不同比例的PBLG-co-PZLL都显示出较窄的分散度，且得到的杂聚多肽的组成与投料比基本一致，表明杂聚多肽的组成易于调整（图5a）。除了BLG-NCA和ZLL-NCA外，作者也尝试了其他NCA单体的聚合。他们从粗NCA混合物有效地制备了一种治疗多发性硬化症的药物醋酸格拉替雷的前体，其组成与理论值非常吻合，证实了该策略的稳健性。作者还尝试在Z-BLG和Z2LL的体系中加入二氯甲基甲醚，得到BLG-NCA与ZLL-NCA的粗二元混合物。该方法的副产物苄基氯可能与链末端氨基发生反应，在正己烷中沉淀后被有效去除（图5b）。此外，克级合成的杂聚多肽也可以得到具有单峰和预期组成的聚合物（图5c）。与毫克级合成相比，分子量略高的原因是大量合成过程中杂质含量较高导致一部分引发剂失活。图5. DCM/DMF/水双相体系中粗NCA混合物制备杂聚多肽 最后，作者将研究范围进一步拓展到水溶性杂聚多肽的简化制备方法（图6）。他们选择了具有叔丁基（tBu）、叔丁氧羰基（Boc）或三苯基甲基（Trt）等酸不稳定保护基团的氨基酸，并在光气化过程中，添加环氧丙烷作为HCl清除剂，得到相应的粗NCA混合物。经过正己烷沉淀、双相聚合和TFA脱保护等过程后，他们成功得到了具有预期组成、窄分散度以及高脱保护效率的水溶性杂聚多肽，可用于各种生物医学研究。 综上所述，作者开发了一种可以从氨基酸混合物中简便制备具有两种或多种侧链的杂聚多肽的方法。这种方法可以有效地去除粗NCA混合物中的杂质，无需繁琐的纯化步骤，并且能得到具有不同链长和组成的杂聚多肽，为杂聚多肽的性质和应用研究提供了新的策略。DOI: 10.1021/acs.biomac.4c00746Link: https://doi.org/10.1021/acs.biomac.4c00746
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