摘 要：目的  对藏药高杯喉毛花Comastomatraillianum的化学成分进行研究。方法 运用RP-HPLC、柱色谱硅胶、葡聚糖凝胶及RP-C₁₈等多种色谱技术进行分离纯化，并根据理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构，并用Griess试剂法测定了化合物对脂多糖（LPS）和γ干扰素（IFN-γ）诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7的抗炎活性，并计算半数抑制浓度（IC₅₀）值评价其抗炎活性。结果  从高杯喉毛花中分离得到了4个裂环环烯醚萜苷类化合物，分别鉴定为高杯喉毛花内脂A（1）、2′-间羟基苯甲酰獐牙菜苷（2）、獐牙菜苦苷（3）、龙胆苦苷（4）。其中化合物1为新化合物，命名为高杯喉毛花内脂A。4个化合物体外抗炎活性测试未显示活性。结论  化合物1～4为首次从高杯喉毛花中分离得到，其中化合物1为新化合物。所有化合物在100 μmol/L的浓度下均未检测到抗炎活性。

高杯喉毛花Comastoma traillianum (Forrest) Holub，一年生草本，是龙胆科（Gentianaceae）喉毛花属Comastoma (Wettst.) Toyokuni植物。该植物在我国主要分布在云南西北部、四川南部，生于海拔3 000～4 200 m草坡、林下、高山草地^[1]。《晶珠本草》记载其为藏医常用药材，性味苦寒，有利湿祛痰、清热解毒、舒肝利胆等功效^[2]。文献报道喉毛花属植物的化学成分主要有黄酮类、酮类、萜类等 ^[3-6]。为充分利用我国丰富的天然植物药资源，进一步开发云南特色植物资源，本实验对产自云南迪庆藏族自治州的高杯喉毛花进行了化学成分研究，并从中分离得到4个裂环环烯醚萜苷类化合物，分别鉴定为高杯喉毛花内脂A（comtraide，1）、2′-间羟基苯甲酰獐牙菜苷（deacetylcentapicrin，2）、獐牙菜苦苷（swertiamarin，3）、龙胆苦苷（gentiopieroside，4），结构见图1。化合物1～4均首次从高杯喉毛花中分离得到。化合物1为新化合物，所有化合物在100 μmol/L的浓度下均未检测到抗炎活性。

1  仪器与材料

1.1  仪器与设备

UV-2401A紫外光谱仪（日本岛津公司）；AgilentUPLC/Q-Tof液质联用仪、安捷伦1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；BRUKERTensor-27傅里叶变换中红外光谱仪（德国布鲁克公司）；Bruker AVANCE III-400M型核磁共振仪（德国布鲁克公司）；X-4数字显示显微熔点测定仪（巩义予华仪器有限公司）；色谱柱为Shimadzushim-pack GIS C₁₈（250 mm×10 mm，5 μm）半制备柱（昆明全和科技有限公司）。

1.2  材料与试剂

柱色谱硅胶（100～200目）、GF254（50 mm×100 mm）硅胶板（青岛海洋化工厂）；SephadexLH-20葡聚糖凝胶（美国AmershamBiosciences公司）；RP-C₁₈ gel（MB 100-40/75 μm，日本FUJI SilysiaChemical Ltd. 公司）；硅胶板显色剂为5%～10% H₂SO₄乙醇溶液；工业级重蒸后石油醚、甲醇、醋酸乙酯；色谱甲醇（北京伊诺凯有限公司）；屈臣氏纯净水。

采自云南省迪庆藏族自治州香格里拉市小中甸海拔3 507 m的高杯喉毛花全草，经云南民族大学杨青松副教授鉴定为高杯喉毛花Comastoma traillianum (Forrest)Holub。本实验中供化学成分分离的为该植物全草。

2  提取与分离

取风干之后的高杯喉毛花全草，粉碎到80目得粗粉3.8 kg，加入95%的乙醇水溶液室温浸泡、超声提取6次，每次用量为6.0 L，每次8 h，提取液经过滤、减压浓缩后得深绿色浸膏1.087 kg。将该浸膏用1.5 kg（100～200目）硅胶拌样，烘干，用5.5 kg硅胶（100～200目）干法装柱进行柱色谱分离，分别采用醋酸乙酯-甲醇（50∶1、30∶1、10∶1、1∶1、0∶1）进行梯度洗脱，经TLC检测分析合并相同组分，分成5个部分。选取醋酸乙酯-甲醇50∶1洗脱部分滤过后经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，采用纯甲醇为流动相进行洗脱，经TLC检测分析合并相同组分，得到6个部分A1～A6。将A5（6.3 g）部分进行RP-C₁₈反相柱色谱进一步分离，以甲醇-水（10∶90→100∶0）进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC检测合并相同组分，得到B1～B12部分。将B8部分进行重结晶得到化合物1（35.3 mg）。将B10部分经高效液相色谱进行分离，以65%甲醇-水溶液为流动相，体积流量为3 mL/min，收集18.5 min的色谱峰多次累加后蒸干得化合物2（8.5 mg）；收集23.5 min的色谱峰多次累加后蒸干得化合物3（6.4 mg）；收集28.3 min的色谱峰多次累加后蒸干得化合物4（9.4 mg）。

3  结构鉴定

化合物1：白色针状结晶（甲醇），mp 144～146℃，[α]20.3D+81.652°(c 0.23, MeOH)；(nm): 210 (3.83), 240 (3.44), 273(3.26)；(cm⁻¹): 3 419,  2 967, 1 716, 1 680, 1 617, 1 456, 1 427, 1290, 1 230, 1 074, 949, 813, 755, 556；HR-ESI-MS显示其准分子离子峰为m/z499.120 9 [M＋Na]⁺（计算值499.121 1），结合¹H-和¹³C-NMR谱确定分子式为C₂₃H₂₄O₁₁，不饱和度为12。红外光谱中显示了羟基（3 419 cm⁻¹）、羰基（1 716 cm⁻¹）和芳环（1 617、1 456和1 427 cm⁻¹）的共振吸收峰。紫外光谱在210、240、273 nm处有最大吸收证明该化合物中存在芳环结构。化合物的¹H-、¹³C-NMR和DEPT数据（表1）显示化合物中存在23个碳和24个氢，其中包括3个亚甲基，14个次甲基，6个季碳（包括2个共轭羰基碳）。氢谱显示的δ_H 3.41～4.96的信号和碳谱显示的δ_C 103.1 (d)、75.9 (d)、75.6 (d)、71.2 (d)、78.6 (d)、62.3 (t) 信号可知，该化合物中存在1个吡喃葡萄糖基结构单元，此外根据氢谱显示的δ_H 5.37 (1H, d, J = 3.1 Hz, H-1)、δ_H 7.44 (1H, s, H-3)、δ_H5.32 (1H, m, H-6)、δ_H 4.88～4.97 (2H, m,H-7)、δ_H 5.43 (1H, m, H-8)、δ_H 3.16 (1H, m, H-9) 特征质子信号表明该化合物中存在1个裂环环烯醚萜单元 (C-1～11)，根据氢谱中H-2″～6″信号出现的1个brs峰、2个d峰、1个t峰，表明该化合物存在1个1,3-二取代的苯环 (C-1″～6″)。通过化合物核磁共振数据之间的比较，发现和已知化合物2相似，可初步推测化合物1可能为裂环环烯醚萜苷类^[7]。此外，化合物1的HMBC谱中（图2）观察到H-3 (δ_H 7.44) 和C-11 (δ_C 166.2)；H-7 (δ_H 4.97) 和C-11；H-6 (δ_H 5.32) 和C-7 (δ_C 70.9)；H-10 (δ_H 5.06) 和C-8 (δ_C 132.9) 以及H-8 (δ_H 5.43) 和C-9 (δ_C 46.1) 的HMBC相关，确定该化合物的环烯醚萜结构单元。根据H-1 (δ_H 5.37) 与C-1′ (δ_C 103.1) 的HMBC相关，可推测葡萄糖基的C-1′取代在C-1位；根据H-2′ (δ_H 4.96) 与C-1′ (δ_C 103.1)；H-2′ (δ_H 4.96) 与C-7″ (δ_C 167.1) 的HMBC相关，可知C-7″取代在糖的C-2′位。根据H-2″ (δ_H 7.46) 与C-7″的HMBC相关可知C-7″取代在苯环的C-1″位。再根据H-1′的 偶合常数为7.8 Hz，表明C-1为β-构型^[8]，另外在ROESY谱中未找到H-1和H-9的相关点，表明H-9为β-构型。至此化合物1的结构得到确认，并命名为高杯喉毛花内脂A。

图2 化合物1的主要HMBC ()相关

Fig.2  KeyHMBCcorrelations()ofcompound1

化合物2：白色无定形粉末，ESI-MS m/z: 479.45 [M＋H]⁺；¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 7.44 (1H, d, J = 7.7Hz, H-6″), 7.40 (1H, brs, H-2″), 7.30 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-3), 7.24 (1H, t, J= 7.9 Hz, H-5″), 7.00 (1H, dd, J =8.1, 2.5 Hz, H-4″), 5.49 (1H, d, J =6.7 Hz, H-1), 5.43 (1H, m, H-8), 5.29 (1H, dd, J = 17.3, 1.8 Hz, H-10b), 5.22 (1H, dd, J = 10.3, 1.9 Hz, H-10a), 4.95 (1H, m, H-1′), 4.58 (1H, m, H-2′),4.27 (1H, m, H-7b), 3.92 (1H, m, H-7a), 3.86 (1H, dd, J = 12.0, 2.1 Hz, H-6′b), 3.82 (1H, m, H-6′a), 3.73 (1H, m, H-3′),3.44 (1H, m, H-4′), 3.35 (1H, m, H-5′), 2.66 (1H, m, H-9), 2.62 (1H, m, H-5),1.62 (1H, m, H-6b), 1.53 (1H, m, H-6a)；¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD) δ: 167.5 (C-7″), 167.3 (C-11), 158.8(C-3″), 153.4 (C-3), 132.8 (C-8), 132.1 (C-1″), 130.8 (C-5″), 121.7 (C-6″),121.6 (C-10), 121.0 (C-4″), 117.0 (C-2″), 105.9 (C-4), 97.4 (C-1′), 97.0 (C-1),78.7 (C-5′), 75.4 (C-3′), 75.3 (C-2′), 71.8 (C-4′), 69.4 (C-7) .62.6 (C-6′).43.3 (C-9), 28.7 (C-5), 25.6 (C-6)。以上数据与文献报道基本一致^[9]，故鉴定化合物2为2′-间羟基苯甲酰獐牙菜苷。

化合物3：白色无定形粉末，ESI-MS m/z: 389.37 [M＋H]⁺；¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 7.63 (1H, s, H-3), 5.72 (1H, d, J = 1.3 Hz, H-1), 5.44 (1H, m, H-8), 5.36 (1H, dd, J = 17.0, 2.5 Hz, H-10b), 5.29 (1H, dd, J = 9.4, 2.6 Hz, H-10a), 4.75 (1H, m,H-7b), 4.64 (1H, d, J = 7.9 Hz,H-1′), 4.34 (1H, m, H-7a), 3.89 (1H, dd, J= 12.0, 1.9 Hz, H-6′b), 3.67 (1H, dd,  J = 12.0, 5.6 Hz, H-6′a), 3.38 (1H, m,H-3′), 3.34 (1H, m, H-5′), 3.29 (1H, dd, J= 9.5, 8.8 Hz, H-4′), 3.21 (1H, dd, J = 8.8, 8.1 Hz, H-2′),2.92 (1H, dd, J = 9.1, 1.1 Hz, H-9),1.90 (1H, m, H-6b), 1.75 (1H, brd, J= 13.9 Hz, H-6a)；¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD) δ: 168.9 (C-11), 155.7 (C-3), 134.7(C-8), 122.1 (C-10), 109.7 (C-4), 101.1 (C-1′), 99.9 (C-1), 79.3 (C-5′), 78.6(C-3′), 75.2 (C-2′), 72.3 (C-4′), 66.8 (C-7), 65.1 (C-5), 63.4 (C-6′), 52.7(C-9), 34.6 (C-6)。以上数据与文献报道基本一致^[10]，故鉴定化合物3为獐牙菜苦苷。

化合物4：白色粉末，ESI-MS m/z: 357.33 [M＋H]⁺；¹H-NMR (400 MHz, C₅D₅N) δ: 7.79 (1H, s, H-3), 5.85 (1H, m, H-8), 5.29 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-1), 5.28 (1H, m, H-6),5.15 (1H, m, H-10b), 4.79～4.83 (2H, m, H-7), 4.72 (1H, d, J= 7.8 Hz, H-1′), 4.46 (1H, m, H-10a), 4.34 (1H, dd, J = 11.8, 4.8 Hz, H-6′b), 4.24 (1H, m, H-6′a), 3.93～4.21 (4H, m, H-2′～5′), 3.32 (1H, m, H-9)；¹³C-NMR (100 MHz, C₅D₅N) δ: 163.6 (C-11), 151.0 (C-3), 133.2 (C-8), 127.7 (C-5), 121.2(C-10), 115.0 (C-6), 105.9 (C-4), 104.8 (C-1′), 101.7 (C-1), 79.4 (C-5′), 78.8(C-3′), 75.6 (C-2′), 71.4 (C-4′), 69.9 (C-7), 62.7 (C-6′), 46.3 (C-9)。以上数据与文献报道基本一致^[11]，故鉴定化合物4为龙胆苦苷。

4  化合物的细胞抗炎活性筛选

据文献报道^[12-13]，大多数环烯醚萜类化合物具有抗炎活性，因此对化合物1～4进行了小鼠单核巨噬细胞RAW264.7抗炎活性筛选和细胞毒性（SRB）实验。抗炎活性测试参照文献报道^[14]采用Griess试剂测定法，以S-甲基异硫脲硫酸盐为阳性对照药，S-甲基异硫脲硫酸盐的半数抑制浓度（IC₅₀）为12.2 μmol/L，化合物1～4的IC₅₀值均大于100 μmol/L，结果表明化合物1～4对脂多糖（LPS）和γ干扰素（IFN-γ）刺激RAW 264.7细胞所诱导的诱导性一氧化氮合酶（iNOS）表达没有抑制作用，未检测到抗炎活性；同时化合物1～4在100 μmol/L浓度下对RAW264.7细胞的生长无明显抑制和毒性作用。

5  讨论

喉毛花属植物资源在我国分布广泛，该属植物的化学成分复杂，具有多种药理活性，目前对于藏药喉毛花属植物的研究相对较少，据报道对于长梗喉毛花的化学成分^[15-16]研究较多，近几年也有对于喉毛花属植物的抗烟草花叶病毒^[17]、抗炎^[18]、保肝^[19]等方面活性的研究。本实验通过对喉毛花属植物高杯喉毛花化学成分以及抗炎活性的研究，丰富了喉毛花属植物的化学成分。喉毛花属植物作为一种常用的藏药资源，加强对喉毛花属植物的化学成分以及生物活性研究，为藏药喉毛花的进一步开发提供理论参考。

参考文献（略） 

来  源：马恩广，吴海燕，胡丽娇，魏  敏，陈柯瑾，牟林云，李干鹏. 高杯喉毛花中1个新的裂环环烯醚萜苷类化合物 [J]. 中草药, 2019, 50(9):2023-2027.