点评 | 雷晓光（北京大学化学与分子工程学院）

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Coverimage, @Johan Jarnestad/The Royal Swedish Academy of Science

定向进化 (directed evolution) 是在试管中模拟自然进化过程，通过快速突变和重组等方式人为的产生基因多样性，然后按照特定的需要和目的给予选择压力，筛选出具有期望特征的蛋白质或者核酸。这一概念是在上世纪90年代由美国加州理工学院的化学/生物/工程学家Frances Arnold教授提出的，并广泛运用于生物以及其交叉领域中，特别是酶工程领域。因其在 “酶的定向进化” 中的开创性贡献，Frances Arnold教授获得了2018年的诺贝尔化学奖。

近年来，Arnold教授课题组一系列经典工作正向人们展示着 “酶的定向进化” 在生物催化领域的强大功能。其代表工作有：细胞色素c用于碳硅键的构筑（Science 2016，354，1048）和碳硼键的形成 (Nature 2017, 552, 7683)，细胞色素P450用于烯烃的反马氏氧化 (Science 2017, 358, 215) ，双环丁烷的构建 (Science. 2018, 360, 71) 以及卡宾的碳氢插入反应 (Nature.2019, 565, 67)。

2019年5月10日，Arnold教授课题组又一突破性工作发表在Science上，标题为“Genetically Tunable Enzymatic C‒H Amidation for Lactam Synthesis”报道了P450催化的氮宾碳氢插入反应，高效高选择性的合成了一系列高价值手性内酰胺化合物。此工作展示了定向进化不仅能够改造天然酶催化非天然化学反应，而且更能“跨界”挑战化学合成的极限。博士生Inha Cho以及博士后贾知军为该工作的共同第一作者 (图1)。

图1. 该工作作者合照. 从左至右：Inha Cho, Frances Arnold, Zhi-Jun Jia (贾知军)

惰性C−H键的官能团化被认为是化学的圣杯，根本性地改变着合成化学的逻辑设计。然而，C−H键具有较高的解离能，通常具有较高的热力学稳定性和较低的化学反应性；另一方面C−H键广泛存在有机化合物中，同一化合物中通常含有多个C−H键。因此，C−H键官能团化的位置选择性是传统化学合成中一个极大的难题。传统化学催化主要依靠底物控制去活化特定的C−H键，包括使用含有导向基团的或者仅有一个相对活泼C−H键的底物。另一方面，虽然自然界中酶催化的生化反应具有极高的位置选择性，但是自然界的酶催化的反应种类以及底物范围都非常局限，因而无法提供一个普适性的方法去解决非天然惰性C−H键官能团化的位置选择性问题。

基于定向进化，Arnold教授课题组发展了一系列能催化非天然C−H酰胺化的细胞色素P450酶，并且能够精确控制同一个底物中不同位置C−H键的选择性，从而合成手性α, β, γ内酰胺 (图2A)。其中β内酰胺是抗生素的重要骨架。值得一提的是，仅仅6个突变 (图2B) 就能将催化效率提高500倍至100万TTN，即一分子P450酶可以催化产生100万以上分子的β内酰胺产物。基于此酶催化方法底物适用广泛，立体选择性高，易放大生产且产物纯化简便 (大部分产物直接过滤提纯，图2C)。目前此方法正在工业转化中。

图2. A. 反应总结. B.相关蛋白结构以及突变位点. C. 放大生产以及纯化.

惰性碳氢键（C-H）的官能团化是合成化学领域的重要研究方向，被认为是合成化学的圣杯，它能够在复杂的底物上直接构建出新的碳-碳键（C-C）以及碳-杂原子键(C-N,C-O, C-Si等)，为简洁高效地修饰以及改造化学分子提供了新的思路。由于复杂分子上往往具有多个惰性的C-H，能在底物众多的C-H中实现选择性地官能团化是有机合成化学家们梦寐以求的梦想。P450酶及其变种P411酶是一类含有血红素（heme）的蛋白，他们能够在复杂天然产物上选择性地进行惰性C-H的氧化，是自然界长期进化过程中产生的一种高效的选择性的C-H活化催化剂。近年来，通过蛋白工程技术对P450进行改造，不仅赋予了P450催化非天然反应的全新功能，还可以改变其反应位点，从而实现复杂底物上不同位点的可控C-H活化。

内酰胺（lactams）结构广泛存在于药物分子以及天然产物中，如何简洁高效地合成内酰胺结构是合成化学家的一大难题。通过分子内的金属氮卡宾直接对惰性C-H进行酰胺化是合成具有内酰胺结构分子的一种重要方法，但由于在该过程中原位生成的羰基氮卡宾中间体很容易生成异氰酸酯，从而无法有效进行C-H插入而形成内酰胺结构。2018年，Chang课题组在Science上首次报道了利用三价金属铱的复合物作为催化剂对惰性C-H键进行选择性地氮卡宾插入而生成γ-内酰胺结构。随后，他们设计和合成了手性金属铱催化剂，实现了立体选择性地合成γ-内酰胺结构。虽然手性金属铱催化剂可以立体选择性地合成内酰胺结构，但只能对γ位的C-H键进行氮卡宾插入，从而生成热力学更稳定的γ-内酰胺。手性金属铱催化剂的这种性质，限制了它在立体选择性合成β/δ-内酰胺的应用。

在本文中，France Arnold课题组通过定向进化的手段，成功改造了三种不同的P411突变体。这三种突变体能够高效地（高达1,020,000 total turnover number）进行C-H键不对称氮卡宾插入（25:1的区域选择性，96%的ee值），分别形成手性β-、γ-、δ-内酰胺。他们从实验室已有的血红素蛋白库出发，经过活性测试，筛选出具有催化碳氢键酰胺化的蛋白P411突变体E10-V78F S438A (E10FA)。但E10FA活性很差，也不具备反应位点的选择性，于是对血红素周围的氨基酸进行了饱和突变，通过六轮的饱和突变以及活性筛选，最终得到了特异性活化β位sp3 C-H生成β-内酰胺的内酰胺酶（lactam synthase）LSsp3。该酶不仅具有广谱的底物适应性，还可以高效实现克级制备手性β-内酰胺，这进一步证实了该方法的实用价值，为合成和开发β-内酰胺型抗生素提供了新的思路。在得到LSsp3后，采用相同的策略，通过对E10FA进行两轮饱和突变，他们筛选到另一种内酰胺合成酶LSsp2，该突变体能够选择性地进行δ-位的sp2 C-H活化，从而生成δ-内酰胺。当底物中同时存在β和γ sp3C-H时，作者发现LSsp3并不具有良好反应位点的选择性，该酶会以2.2:1的比例同时产生β-和γ-内酰胺。为了提高sp3 C-H活化的特异性，作者在LSsp3的基础上又进行了定向进化。当在LSsp3引入额外的三个突变（R327P, P329L,和 A330V）后，该突变体LSβ能够选择性活化β位C-H生成β-内酰胺；当引入P329V A330M突变后，该突变体LSγ能够选择性活化γ-位C-H生成γ--内酰胺。令人惊奇的是，当底物上同时存在β-、γ-、δ- sp3C-H时，LSβ，LSγ，和LSsp3可以分别特异性地产生β-、γ-、δ-内酰胺。与传统的贵金属介导的C-H酰胺化相比，经过改造之后的P411酶不仅具有较高的立体选择性和超高的反应效率，更重要的是，它能够生成热力学不稳定的β-内酰胺以及δ-内酰胺，这是以前的方法无法做到的。

France Arnold课题组近年来通过蛋白定向进化技术，致力于改造血红素蛋白，使它具有催化多种非天然反应的能力。目前他们已经成功开发出能够通过卡宾介导的碳氢键活化来形成碳-硅键，或者高能的碳-碳键等全新功能的血红素蛋白。这些例子以及这篇最新的Science工作充分证明了定向进化的强大之处，它可以迅速赋予合成化学家梦寐以求的新的功能，还可以通过控制关键氨基酸位点来精确控制反应位点，这些新的功能都是很难通过自然进化而快速获取的。可以预见在不久的将来，更多、更具挑战性的合成问题有望通过对酶的定向进化来解决。这些被发现的、全新的酶促反应机制将进一步加深合成化学家们对有机化学反应的理解，也将进一步丰富合成化学们的合成策略，为高效制备复杂分子提供新的思路。

制版人：小娴子