摘  要：目的  挖掘夏枯草中可能调控三萜和酚酸类产物生物合成的MYB转录因子。方法  从夏枯草转录组数据库中筛选MYB转录因子，并对蛋白基序、理化性质、功能注释、系统进化、表达特性等进行分析，并预测其功能。结果  在夏枯草转录组水平上共鉴定出参与27个MYB转录因子基因，c32045.graph_c0可能通过对肉桂酸4-羟化酶基因表达的抑制作用，阻碍迷迭香酸的生物合成，从而作为转录抑制子对酚酸类产物生物合成起负调控作用。c26895.graph_c0可能通过调节三萜类和迷迭香酸类产物合成过程中的代谢中间产物的流向，从而阻碍三萜类和酚酸类的生物合成。结论  该研究预测了调控夏枯草三萜类和酚酸类产物生物合成的相关MYB转录因子，也为进一步研究夏枯草MYB转录因子在次生代谢产物中的调控功能奠定了基础。

转录因子是一群能与基因上游特定序列专一性结合，通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。MYB类转录因子家族含有由若干个包含50～53个氨基酸残基的重复序列构成的MYB结构域，具有高度保守的氨基酸残基和间隔序列^[1]。植物中的MYB转录因子，广泛地参与到植物生长发育的各个领域，在植物次生代谢产物生物合成过程中发挥重要调节作用^[2]。MYB转录因子可参与调节次生代谢物生物合成途径中多个相关基因协同表达，从而有效调节次生代谢产物生物合成途径^[3]。现今快速发展的高通量测序和生物信息学为基因的鉴定和功能分析提供新手段和新方法。

夏枯草Prunella vulgaris L.为唇形科夏枯草属多年生草本植物，是一种传统而常用的中药，常代替茶作为凉茶配料，其干燥果穗有降火功效。夏枯草中含多种三萜类及酚酸类等次生代谢产物，如常见的熊果酸、齐墩果酸、咖啡酸及迷迭香酸等，使其具有降血压、降血糖、调节免疫、保肝以及抗炎、抗菌、抗病毒等作用^[4]。目前关于夏枯草MYB转录因子家族基因研究报道比较少，严重影响了夏枯草的次生代谢生物合成的研究，因此有必要对夏枯草MYB转录因子家族进行分析和鉴定。本研究基于高通量测序方法构建的转录组数据库，利用生物信息学手段对夏枯草MYB转录因子进行系统的分析，为进一步探究夏枯草MYB转录因子家族基因的功能奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

本研究所用夏枯草采自河南省确山县夏枯草GAP种植基地，并经河南中医药大学董诚明教授鉴定为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.。本实验夏枯草MYB转录因子来自于实验室所构建的转录组数据库。拟南芥MYB转录因子家族氨基酸序列下载于拟南芥信息资源（PlantTFDB）数据库（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）。

1.2  夏枯草MYB转录本筛选

高通量测序由北京百迈客生物科技有限公司完成，拼接组装后获得夏枯草转录组，筛选后获 59条MYB基因序列，采用基因ID搜索获取氨基酸序列，使用ORF Finder在线软件分析预测开放阅读框（ORF），获得具有全长氨基酸序列的夏枯草MYB转录因子家族蛋白基因序列。

1.3  夏枯草MYB转录因子蛋白基序分析鉴定

运用The MEME Suite4.12.0（http://meme-suite. org/）程序分析夏枯草MYB家族蛋白的基序，设定基序宽度最小值为6、最大值为50，基序数量为10，其余参数为默认值。应用结构域在线分析软件SMART（http://smart.embl.de/）对保守结构域进行分析。

1.4  夏枯草MYB转录因子蛋白的结构分析

选择具有全长氨基酸序列的夏枯草MYB转录因子家族蛋白，利用在线工具ProtParam（http://web. expasy.org/protparam/）对一级蛋白进行理化性质分析。利用在线软件SOPMA（https://npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）对蛋白二级结构特征进行预测。

1.5  夏枯草MYB转录因子的GO注释分析

使用BLAST2GO软件对筛选获得的夏枯草MYB转录因子进行功能注释分析。

1.6  夏枯草MYB转录因子与拟南芥MYB转录因子构建系统进化树

拟南芥MYB转录因子的蛋白序列从PlantTFDB数据库中下载，完整的氨基酸序列用于进化分析。利用MEGA 5.1软件内置的Clustal W 程序对夏枯草MYB家族蛋白的氨基酸序列和下载的拟南芥所有MYB转录因子的蛋白序列进行比对分析，将比对结果采用邻接法构建系统发育树，并进行自举评估，重复次数为1 000次，其他参数使用默认值。

1.7  夏枯草次生代谢相关MYB转录因子功能分析

通过夏枯草MYB转录因子与拟南芥所有MYB转录因子构建的系统进化树，筛选获得与各个夏枯草MYB转录因子相似性最高的拟南芥MYB转录因子，然后通过检索文献预测MYB转录因子的分子功能。

1.8  夏枯草MYB转录因子表达分析

基于转录组数据，获取夏枯草MYB转录因子在果穗、叶、茎组织表达量，采用MEGA软件对27个MYB 转录因子在各组织表达数据进行分层聚类分析。

2  结果与分析

2.1  夏枯草MYB家族成员的获得

从夏枯草转录组数据库中共筛选出59条MYB基因序列，片段大小为246～5 133 bp。通过ORF预测全长氨基酸序列，发现27条序列具有完整的ORF，片段最短的为510 bp（c31075. graph_c0），编码的169个氨基酸，片段最长的为5 133 bp（c37346.graph_c0），编码1 710个氨基酸。片段平均长度为981 bp。

2.2  夏枯草MYB转录因子基序分析

通过MEME软件分析了27个夏枯草MYB转录因子家族的10个基序（图1），发现27个蛋白均具有基序2，除c31075.graph_c0、c31792.graph_c0、c33855.graph_c0、c41049.graph_c0外，其他均具有基序1。进一步分析保守的motif序列特征发现，基序1为典型的R2R3保守结构域基序，基序2为一段保守的MYB结构域。基序1存在于所有R2R3-MYB，基序2存在于所有具有全长的MYB家族蛋白。说明除c31075.graph_c0、c31792.graph_c0、c33855.graph_c0、c41049.graph_c0编码蛋白外其余23个蛋白均为R2R3-MYB家族蛋白。

2.3  夏枯草MYB家族蛋白理化性质分析

夏枯草MYB家族一级蛋白的理化性质分析结果（表1）表明，27个MYB家族蛋白的平均相对分子质量为36 470，最小值为c31075.graph_c0编码蛋白的19 470.65，最大值为c37346.graph_c0编码蛋白的187 738.19。等电点（pI）平均值为7.79，最小值为c12027.graph_c0编码蛋白的5.05，最大值为c33161.graph_c0编码蛋白的9.95，其中有7个MYB家族蛋白pI小于7（偏酸性），17个蛋白pI大于7（偏碱性），说明大多数夏枯草MYB家族蛋白表现为偏碱性。MYB家族蛋白的平均疏水性值均较均小于0，说明27个夏枯草MYB家族蛋白均属于疏水蛋白。MYB家族蛋白二级结构特征预测结果显示，27个夏枯草MYB蛋白均具有α螺旋、无规卷曲、延伸链和β转角4种构型，主要由α螺旋和无规卷曲构成（所占比平均值分别为35%和53%）延伸链和β转角所占比例较小（所占比平均值分别为7.8%和4.9%），c23022.graph_c0、c33161.graph_c0、c34744.graph_ c0、c41391.graph_c04个基因编码蛋白α螺旋所占比例最大，其余23个MYB蛋白均表现为无规卷曲所占最大比例。

2.4  夏枯草MYB转录因子的GO注释分析

GO注释分析表明，夏枯草27条MYB转录因子序列中分别有17条、23条和15条被注释到生物过程、分子功能和细胞组分，所有的序列被进一步富集为21个功能类别，其中细胞过程（17个）、发育过程（16个）、代谢过程（15个）、生物调节（14个）、生物过程调节（14个）、结合活性（23个）、转录调节活性（12个）、细胞部分（15个）、细胞器（15个）、细胞（15个）等功能组中包含的序列较多，生物过程的正调节（3个）、生殖过程（2个）、细胞成分组织或生物发生（2个）、生物过程的负调节（2个）、增长（2个）、信号（1个）、细胞增殖（1个）、薄膜（1个）等功能组中包含的序列较少。其中生物过程主要富集在细胞过程，分子功能集中富集在结合调控上，细胞组分主要富集在细胞部分。综上，夏枯草MYB转录因子通过结合到DNA区域发挥相应的调控功能，主要涉及植物的细胞过程、发育过程和物质代谢等过程（图2）。

2.5  夏枯草MYB蛋白进化分析

为了研究夏枯草MYB蛋白的进化关系并预测其功能，从PlantTFDB数据库中下载拟南芥所有168个MYB家族蛋白氨基酸序列^[5]，采用软件MEGA5.1构建夏枯草MYB家族蛋白和拟南芥MYB家族蛋白进化树。由图3可以看出，夏枯草MYB家族蛋白与拟南芥MYB家族蛋白可聚类分为18个亚组，大部分夏枯草MYB家族蛋白与拟南芥的MYB蛋白聚集在不同亚组，且比较分散，说明夏枯草MYB家族蛋白与拟南芥MYB蛋白具有比较高的保守性。与拟南芥相同亚组的夏枯草MYB蛋白具有与拟南芥MYB蛋白相似的功能，模式植物拟南芥R2R3-MYB家族蛋白中第S3、S4、S5、S6、S7、S12亚族参与调控拟南芥的次生代谢产物生物合成过程^[6]（S3亚族编码基因包括AT1G79180.1、AT1G16490.1；S4亚族编码基因包括AT4G38620.1、AT4G34990.1、AT2G16720.1、AT1G22640.1；S5亚族包括AT5G35550.1；S6亚族编码基因包括AT1G66370.1、AT1G66380.1、AT1G66390.1、AT1G56650.1；S7亚族编码基因包括AT5G49330.1、AT2G47460.1、AT3G62610.1；S12亚族编码基因包括AT5G60890.1、AT1G74080.1、AT1G18570.1、AT5G61420.2、AT5G07700.1），故与S3、S4、S5、S6、S7、S12同一亚组的c33161.graph_c0、c27287.graph_c1、c26895.graph_c0、c33772.graph_c0、c32045.graph_c0编码的夏枯草MYB蛋白也可能参与调控夏枯草的次生代谢过程。

2.6  夏枯草次生代谢相关MYB转录因子功能分析

通过构建夏枯草MYB转录因子与拟南芥所有MYB转录因子系统进化树，筛选与它们同源性较高的拟南芥MYB转录因子，然后通过检索文献分析MYB转录因子的分子功能。由表2可知，MYB转录因子基因c26895.graph_c0编码蛋白同源性较高的拟南芥转录因子ATMYB111、ATMYB11、AtMYB12可以正向调节参与黄酮醇生物合成的生物合成基因的表达，还可以增强植物非生物胁迫耐受性，推测夏枯草转录因子基因c26895.graph_c0可能能够调节黄酮醇的生物合成；MYB转录因子基因c32045.graph_c0编码蛋白同源性较高的拟南芥转录因子ATMYB4、ATMYB3、ATMYB7具有负调节C4H的转录并调节芥子酸酯生物合成的功能，推测夏枯草MYB转录因子可能具有抑制C4H的转录表达的功能。

2.7  夏枯草MYB转录因子基因表达分析

基于夏枯草转录组数据，获得夏枯草MYB转录因子在果穗、叶、茎各个组织基因表达量，并绘制热图。图4表明MYB转录因子在组织表达模式上存在差异，大多数成员在果穗、叶和茎组织中均有表达，表达模式呈现多样化。夏枯草MYB转录因子各组织表达量聚类为3大类（包括7个小类），其中有4个MYB转录因子基因在叶中表达上调，15个MYB转录因子基因在茎中表达上调，8个MYB转录因子基因在果穗中表达上调，而夏枯草三萜类与酚酸类次生代谢产物主要在果穗积累，其药用部位也为果穗^[13]。夏枯草MYB转录因子c26895.graph_c0、c32045.graph_c0基因均在茎中表达量上调，在果穗中表达量下调，根据表达模式分析：夏枯草MYB转录因子c26895.graph_c0、c32045.graph_ c0负向调节三萜类与酚酸类的生物合成。这也与功能预测一致。

3  讨论

夏枯草作为一种传统而常用的中药，其在临床及中成药中应用的不断扩大，化学成分、药理作用等方面的研究也不断深入，但其分子遗传和基因组方面的研究还未见报道，严重影响了夏枯草的次生代谢生物合成的研究，限制了夏枯草的进一步开发利用，本研究是基于前期获得的夏枯草转录组数据库基础上，对夏枯次生代谢生物合成相关转录因子基因进行挖掘及分析，对后续明晰了夏枯草生物三萜类和酚酸类合成的分子途径奠定了基础。

萜类次生代谢产物的生物合成有2条途径：甲羟戊酸（MVA）途径和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸盐（MEP）途径，三萜类物质（齐墩果酸和熊果酸）主要是以MVA途径合成的，MVA途径的起始底物为乙酰辅酶A^[14]；迷迭香酸为其他更为复杂的酚酸类化合物的代谢前体，迷迭香酸的生物合成有2条支路途径：苯丙氨酸途径和酪氨酸途径。苯丙氨酸生成肉桂酸，肉桂酸在C4H和4-香豆素CoA连接酶（4CL）的催化下生成苯丙氨酸支路途径的产物4-香豆酰CoA。酪氨酸生成4-羟基苯乳酸。4-羟基苯乳酸与4-香豆酰CoA生成2-氧-(4-香豆酰)-3-(4-羟基苯)-乳酸，最后由细胞色素P450催化生成迷迭香酸^[15]。黄酮醇生物合成是类黄酮化合物合成途径的一个分支，植物类黄酮的生物合成需要2种起始底物：苯丙烷类代谢途径生成的4-香豆酰CoA和三羧酸循环生成的丙二酰辅酶A^[16]。夏枯草转录因子c32045.graph_c0可能通过对迷迭香酸合成过程相关酶C4H基因表达的抑制作用，阻碍迷迭香酸的生物合成，从而作为转录抑制子对酚酸类生物合成起负调控作用。夏枯草MYB转录因子基因c26895.graph_c0编码蛋白可能通过促进黄酮醇的生物合成，使三萜类生物合成起始底物乙酰辅酶A（乙酰辅酶A羧化为丙二酰辅酶A）和迷迭香酸类合成过程中的代谢中间产物4-香豆酰CoA流向黄酮醇合成途径，从而阻碍三萜类和酚酸类的生物合成。

参与调控夏枯草三萜类及酚酸类转录因子数目众多，本研究仅从相关性分析、功能预测方式初步筛选出4个可能的MYB负调控转录因子，并初步分析了c32045.graph_c0和c26895.graph_c0 2个MYB转录因子作用方式，其具体的功能仍需后续实验进一步验证。

参考文献（略） 

来  源：朱畇昊，张梦佳，李  璐，赵  乐，董诚明. 夏枯草三萜和酚酸类合成相关的MYB转录因子的挖掘及分析 [J]. 中草药, 2019, 50(9):2165-2171.