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糖基化修饰是一种广泛存在且重要的蛋白质翻译后修饰，参与调控多种生命活动。同时，包括抗体、人促红细胞生成素（EPO）、疫苗在内的许多临床治疗性蛋白质都具有特异性糖基化修饰，且对蛋白活性至关重要【1,2】。由于糖链结构的复杂性和不均一性，如何获得固定糖型的均一糖蛋白是治疗性蛋白质生产的一大难题。基于糖基转移酶的化学酶法合成方法，具有无需保护基团、立体可控和高效便捷等优势，具有巨大的应用潜力【3】。因此，找寻性质优良的各种糖基转移酶十分关键。对比真核细胞，细菌来源的糖基转移酶具有易表达纯化和催化产率高等优良性质，常被改造为人工合成糖蛋白的工具酶。例如，空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）来源的糖基转移酶PglB，因与真核生物中N-连接糖蛋白糖基转移酶OST同源，两者识别相似的Asn序列子(N-X-S/T)，被改造为生产N-连接糖蛋白的工具酶【4,5】。

然而，蛋白O-连接糖基化修饰在原核生物与真核生物之间并不保守。细菌自身的糖基转移酶采用有别于真核生物的糖供体，且更偏好修饰自身的底物蛋白质【6】，这成为了利用细菌糖基化系统生产真核生物O-糖蛋白的一大瓶颈。为了解决这个问题，北京大学化学与分子工程学院陈兴教授课题组对病原菌-宿主相互作用中的蛋白质糖基化进行了探索。

某些病原菌入侵宿主细胞后，会分泌一类具有糖基转移酶活性的效应蛋白。这些效应蛋白往往利用宿主的糖供体，并且修饰宿主的靶蛋白【7】。因此，对这类糖基转移酶的工程化，可为实现真核生物O-糖蛋白的合成提供新的有效策略。然而，由于缺乏灵敏高效的底物鉴定方法，目前仅对少量的效应蛋白糖基转移酶进行了生化性质研究，而它们仅能修饰特定的宿主蛋白【8】。类似真核生物中的广谱O-糖基化系统 (general O-glycosylation system) 亟待被发现。

2019年1月7日，陈兴课题组在Nature Chemical Biology上发表了题为Legionella effector SetA as a general O-glucosyltransferase for eukaryotic proteins的研究论文，报道利用一种高效的、具有修饰位点特异性的化学酶法标记策略，实现了对嗜肺军团菌效应蛋白糖基转移酶SetA的蛋白底物鉴定，首次发现其修饰的蛋白底物具有S/T-X-L-P/G序列保守性, 阐明了SetA的底物选择机理，并将其开发为一种新型糖蛋白合成工具酶，推广了其实际应用价值。

为实现糖基转移酶的低丰度蛋白底物鉴定，研究人员首先开发了能够实现特异性标记和选择性富集的化学酶法策略。他们设计被SetA利用的生物正交基团修饰的糖供体（尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖，UDP-6AzGlc），从而将叠氮葡萄糖6AzGlc转移至底物蛋白。通过点击化学反应，与可切割生物素探针连接，实现对底物蛋白的选择性富集和位点特异性质谱鉴定(下图)。

化学酶法标记策略流程示意图

研究人员利用体外自糖基化体系，证明化学修饰的糖供体类似物UDP-6AzGlc确实可被糖基转移酶SetA利用。接着，在细胞裂解中的体外糖基化反应后进行选择性富集，发现SetA能够修饰多种真核底物蛋白。进而利用位点特异性质谱分析，鉴定到317个高置信O-glucose修饰位点，包括45个丝氨酸和272个苏氨酸位点，分布于276种蛋白。进一步通过对蛋白的天然糖供体标记及军团菌侵染实验，验证SetA确实可以修饰众多的底物蛋白(下图)。

SetA底物蛋白的鉴定

由于目前尚未发现病原菌的效应蛋白糖基转移酶能够实现对非同家族蛋白的多种底物蛋白的修饰，研究人员猜测SetA可能具有特殊的底物选择机制。通过对317个O-glucose修饰位点的序列分析，发现被修饰蛋白具有S/T#-X-L-P/G (#为修饰氨基酸)序列保守性，且将+2位的Leu替换为其他疏水氨基酸(如Val/Phe) 会降低修饰率，而替换为极性氨基酸(如Arg)则会完全废除修饰，说明了SetA具有+2位疏水氨基酸的底物偏好性。

为进一步从结构方面阐明SetA的底物选择机理，在北大来鲁华教授课题组帮助下，采用同源建模方法，搭建了SetA核心催化结构域的结构模型。结构模型显示，在糖供体结合口袋邻近处，有一明显的疏水区域。将此位置的疏水性质破坏后，显著降低了SetA的底物修饰效率(下图)。随后，研究人员将SetA选择性识别的S/T-X-L-P/G保守性序列，开发为O-glucosylation 标签 (GlcTag)，实现了真核生物蛋白的位点特异性O-糖基化修饰。

 SetA识别S/T-X-L-P/G保守序列

综上所述，这项研究开发了化学酶法标记策略，实现了对军团菌效应蛋白糖基转移酶SetA的底物蛋白鉴定，揭示了SetA的底物修饰具有S/T-X-L-P/G序列选择性。首次发现了原核生物中广谱O-糖基化系统，为糖蛋白的人工合成提供了有力的工具(下图)。该化学酶法标记富集策略可推广应用到多种糖基转移酶的底物蛋白鉴定，促进更多的糖合成工具酶的开发，进而实现各种糖蛋白的精准合成。

据悉，北大化学院陈兴教授为本研究论文的通讯作者，北大-清华生命科学联合中心博士研究生高玲为第一作者。北大化学院来鲁华教授，北京生命科学研究所邵峰研究员和北大生科院肖俊宇研究员参与了该课题研究。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-018-0189-y

1.Walsh, G. & Jefferis, R. Post-translational modifications in the context of therapeutic proteins. Nat. Biotechnol. 24, 1241–1252 (2006).

2.Jefferis, R. Glycosylation as a strategy to improve antibody-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov 8, 226–234 (2009).

3.Li, C. & Wang, L.-X. Chemoenzymatic Methods for the Synthesis of Glycoproteins. Chem. Rev. 118, 8359–8413 (2018).

4.Schwarz, F. et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol 6, 264–266 (2010).

5.Valderrama-Rincon, J. D. et al. An engineered eukaryotic protein glycosylation pathway in Escherichia coli. Nat Chem Biol 8, 434–436 (2012).

6.Nothaft, H. & Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat Rev Micro 8, 765–778 (2010).

7.Lu, Q., Li, S. & Shao, F. Sweet Talk: Protein Glycosylation in Bacterial Interaction With the Host. Trends in Microbiology 23, 630–641 (2015).

8.Jank, T., Belyi, Y. & Aktories, K. Bacterial glycosyltransferase toxins. Cell Microbiol 17, 1752–1765 (2015).