当前，因各种原因造成骨缺损的发病率越来越高，由此引起的肢体功能障碍已严重影响患者的生活质量。骨移植被作为一种常用的治疗手段，但存在供源紧缺、完全愈合率低、术后并发症及免疫排斥反应等弊端，因此在临床应用中严重受限^[1]。至今，骨缺损尚无良好的治疗方法，已成为全球亟待解决的医学难题。近些年，以干细胞为核心的组织工程与再生医学的飞速发展，在临床应用方面展示了巨大的潜力，为治愈这一顽疾带来了新的希望。

间充质干细胞（mesenchymalstem cells，MSCs）是一种具有自我更新能力的多能干细胞，具有免疫调节功能、来源丰富、易获取等特点^[2]，是骨组织工程优良的种子细胞。诱导MSCs向成骨分化是骨组织工程治疗的重要步骤。在诱导干细胞成骨分化的众多方法中，利用天然小分子化合物促进干细胞分化具有明显的优势。天然小分子化合物不仅来源广、种类多、数量足、易获得、结构可控，而且可以高效、可逆、定向和准确地诱导细胞分化，乃至实现体细胞重编程和转分化。这些优点为干细胞组织工程疗法的大规模应用提供了可能^[3-5]。近年来，天然小分子化合物诱导干细胞成骨分化越来越受到人们的关注。目前，已发现多种天然小分子化合物可高效、定向诱导MSCs向成骨细胞分化，为干细胞命运定向调控开辟了新的方向，并且可能会对解决干细胞在组织修复和再生医学中的关键问题提供全新的方案。本文对近几年天然小分子诱导间充质干细胞成骨分化的研究进展进行综述，以期为天然小分子化合物联合MSCs在骨组织工程的临床应用提供启示。

1  黄酮类

黄酮类化合物多存在于植物的根、茎、叶、果实、种子中，多具有抗氧化和抗菌作用^[6]。近来研究发现，黄酮类化合物对干细胞的增殖、凋亡、分化亦具有调控作用，可抑制骨吸收和促进干细胞成骨分化^[7]。

1.1  槲皮素

槲皮素是一种具有广泛生理活性的黄酮类化合物^[8]。最近研究发现槲皮素通过雌激素（ER）介导的骨形态发生蛋白（BMP）信号转导，调节转录因子Runx2和Osx的表达并最终刺激小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）的成骨分化和矿化^[9]。槲皮素能激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路刺激BMP2的产生，从而诱导大鼠间充质干细胞（rBMSCs）的成骨分化，同时增加细胞外调节蛋白激酶（ERK）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、BMP2和核心结合因子α1（CBFα1）的表达^[10]。尤其是在分化中后期，槲皮素通过调节ERK还可以随剂量增加而促进血管内皮生成因子（VEGF）和血管生成素-1（ANG-1）的分泌，而VEGF可增加小静脉数和小静脉的通透性，促进细胞质钙的积累，并诱导血管生成^[11]。研究表明，槲皮素通过VEGF可刺激rBMSCs的增殖和成骨，并通过刺激内皮细胞分泌骨合成代谢生长因子间接促进成骨细胞的增殖和分化^[12]。另外，负载槲皮素的微球显著增加了成骨细胞中碱性磷酸酶（ALP）活性，同时提高了RUNX2基因和蛋白的表达量^[13]。在成骨细胞分化中，槲皮素混合配体铜络合物处理可增加细胞水平的钙沉积和ALP活性，并在分子水平上刺激mRNA和蛋白的表达，ALP的mRNA和I型胶原mRNA表达^[14]。总之，槲皮素是骨缺损修复和再生有力的候选者，首先是因为其能促进干细胞成骨，其次还能诱导管VEGF和ANG-1的分泌，从而间接促进骨形成。

1.2  葛根素

葛根素是一种具有抗炎、抗肿瘤、肾保护等广泛药理作用的异黄酮^[15]。而且，葛根素有骨质保护和促进干细胞成骨分化的作用。研究表明，葛根素能通过抑制蛋白激酶B（Akt）活化，预防脂多糖（LPS）诱导的破骨细胞形成和骨丢失^[16]。其还可以通过MAPK信号传导途径促进rBMSCs的成骨分化，并且可以防止卵巢切除大鼠骨密度降低和改善股骨小梁骨结构^[17]。葛根素可增加分泌型糖蛋白5b（Wnt5b）的表达，诱导rBMSCs分化为成骨细胞，提示其成骨分化可能与分泌型糖蛋白（Wnt）信号通路有关^[18]。葛根素还可通过NO/环磷酸鸟苷（cGMP）/蛋白激酶G II（PKG II）信号传导途径起作用的雌激素受体介导，促进人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的增殖和成骨细胞分化^[19]。

2  酚类

多酚是植物界常见的天然产物，可改善神经退行性疾病、心血管疾病、癌症和骨质疏松症等疾病的症状^[20]。研究表明，白藜芦醇、姜黄素和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）等多酚类天然小分子化合物具有重要的促MSCs成骨效应。

2.1  白藜芦醇

白藜芦醇是具有二苯乙烯母核结构的非黄酮类多酚化合物，亦被认为是抵御病原菌入侵的植物抗毒素^[21]。研究结果提示，白藜芦醇能增加I型胶原N端前肽（P1NP）和骨保护素（OPG）的表达，并使ALP水平增加3倍，促进hBMSCs向成骨细胞分化^[22]。而且，其能够通过刺激组蛋白去乙酰化酶1/Runx转录因子2（Sirt-1/Runx2）调节成骨，并经由抑制核因子-κB配体的受体激活剂（Rankl）表达来阻滞破骨细胞的分化^[23]。此外，白藜芦醇通过调节大鼠骨形态发生蛋白和骨桥蛋白基因表达来改善骨修复^[24]。进一步的研究表明，白藜芦醇可逆转肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的促凋亡作用并逆转TNF-α诱导的成骨损伤，抑制TNF-α激活的NF-κB信号传导，缓解炎性细胞因子对成骨分化的抑制作用^[25]。白藜芦醇还可激活ER依赖性ERK1/2通路，促进hBMSCs的增殖和成骨分化^[26]。另外，白藜芦醇能增强Wnt信号途径，促进MSCs成骨分化和骨形成^[27]。

2.2  姜黄素

姜黄素是一种具有β-二酮结构的多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌等广泛的药理作用^[28]。最新研究表明，姜黄素通过增加无远端同源框5（Dlx5）、Runx2、ALP和Ocn等基因的表达，诱导小鼠胚胎间充质干细胞（C3H10T1/2）的成骨细胞分化^[29]。其还能增加血红素加氧酶（HO）-1表达，上调ALP活性和Runx2和Ocn等成骨细胞特异性因子转录水平的表达，调控rBMSCs成骨形成^[30]。其通过减弱氧化应激和抑制Wnt/β-catenin信号传导，间接诱导人脂肪间充质细胞（hADMSCs）向成骨分化^[31]。

2.3  EGCG

EGCG是茶多酚中最有效的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉硬化、抗血管增生等多种药理作用^[32]。有研究表明，EGCG对向成骨谱系发展的hBMSCs具有强烈的刺激作用，特别是在5 μmol/L的浓度下，显著增强ALP活性，促进成骨相关基因表达以及钙化结节的形成^[33]。而且，EGCG能显著抑制缺氧诱导的hBMSCs凋亡，促进ALP、BMP2、PINP和Runx2的表达，这可能与上调MicroRNA 210的表达有关^[34]。EGCG可预防TNF-α诱导hBMSCs的成骨抑制^[35]。EGCG与共轭明胶缀合形成复合物凝胶，可在14 d内诱导mBMSCs的成骨生成^[36]。EGCG对磷酸盐缓冲盐水悬浮后hBMSCs成骨能力也具有显著的影响，4 ℃下在磷酸盐缓冲盐水中悬浮4 d，hBMSCs仍显示出高活力和成骨分化能力^[37]。通过增加成骨相关基因的表达、ALP活性和最终矿化，EGCG增强hBMSCs的成骨分化^[38]。

3  生物碱

小檗碱是从黄连、黄柏中分离得到的一种广泛使用的生物碱，研究表明，其具有抗菌、抗肿瘤、抗高血脂、抗自噬等多种药理活性^[39]。在成骨方面，也具有独特的优势。小檗碱通过ERK-核转录因子（FOS）途径促进人牙周膜干细胞（hPDLSCs）向成骨细胞分化^[40]。结合细胞膜色谱和在线HPLC-MS筛选，小檗碱可促进ALP的分泌，增强矿化结节的形成，显示出其成骨潜力^[41]。小檗碱通过活化p38促分裂原蛋白激酶和增加环氧合酶-2的表达来促进成骨细胞分化^[42]。其不仅可以通过增强Runx2的表达，还可以通过激活经典的Wnt/β-catenin信号通路，刺激hBMSCs的成骨分化^[43]。小檗碱通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进rBMSCs的成骨分化，显示出具有治疗牙周再生的潜力^[44]。

其他生物碱如可可碱、甜菜碱和胡椒碱等也具有成骨功能。可可碱促进hBMSCs的成骨形成，增加股骨厚度和骨小梁参数，并且孕妇补充安全剂量的可可碱可加速其后代的骨骼发育^[45]。甜菜碱通过控制聚水凝胶的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）浓度，调节hBMSCs干性和成骨形成^[46]。胡椒碱通过AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）依赖性调节Runx2表达诱导成骨分化^[47]。

4  三萜类

人参作为传统中药，药用历史悠久，其药用部位为根，主要活性成分是人参皂苷，属于三萜皂苷。人参皂苷Rg₁是人参中含量最高的有效成分。有研究表明其在中枢神经、心血管、内分泌和免疫系统中具有积极作用^[48]。其可增加成骨细胞的数量和ALP的活性及环磷酸腺苷（cAMP）的表达^[49]。其通过调节BMP2/Smad信号通路促进rBMSCs的成骨分化和大鼠胫骨骨折的愈合^[50]；还可以通过改变基因表达促进人牙髓干细胞（hDPSCs）的增殖和成骨分化^[51]。增强人牙周韧带干细胞（hPDLSCs）的增殖和成骨分化的最佳浓度为10 μmol/L^[52]。

此外，其他三萜类化合物也具有成骨效应。齐墩果酸在卵巢切除诱导的骨质疏松大鼠中发挥骨保护作用，并在体外刺激rBMSCs的成骨分化^[53]。柴胡皂苷A在体外刺激mBMSCs的成骨分化，体内促进成骨标志物的表达，并通过Wnt/β-连环蛋白途径发挥针对卵巢切除术诱导的骨丢失的保护作用^[54]。三七皂苷是一种抗骨质疏松剂，具有增强骨矿物质密度和骨强度的作用，并防止切除卵巢的大鼠骨质流失^[55]。研究表明，其通过激活Wnt信号通路改变rBMSCs中Rankl和OPG的水平，促进细胞增殖，增加矿化和ALP活性，从而诱导rBMSCs的成骨形成^[56]。

5  其他

除了上述的小分子外，还有其他天然小分子化合物能够诱导MSCs的成骨分化。例如，虫草素已被证明在骨相关疾病中也具有明显的效应。虫草素通过激活Wnt通路介导对过氧化氢诱导的hBMSCs成骨抑制具有保护作用^[57]。虫草素还可以通过直接减少NF-κB抑制蛋白（IκBα）磷酸化而抑制TNF-α激活的核转录因子-κB（NF-κB）信号通路，达到抗炎的目的，同时在细胞疗法中促进hADMSCs的成骨分化^[58]。在糖尿病性骨病中，虫草素可以剂量依赖的方式恢复循环血糖，同时增加糖尿病大鼠中骨矿物质含量和骨矿物质密度^[59]。诱导MSCs成骨分化的天然小分子化合物见表1。

6  结语

综上所述，天然小分子化合物可以显著影响干细胞的命运，并驱使它们进入成骨分化。这些小分子与细胞膜上的受体相互作用或进入细胞以激活信号通路，然后调节靶基因的表达以诱导干细胞成骨。同时，各种研究中已经引入了许多将天然小分子与不同类型的支架或载体组合的方案，使得这些小分子的组织工程应用进入了新的阶段。鉴于天然小分子对MSCs的影响，它们的组合是用于干细胞组织工程治疗和未来治疗骨缺损很有前景的候选方案。此外，将天然小分子化合物用于骨骼系统疾病治疗，也可为其他组织工程、靶向治疗和癌症等其他致命疾病的治疗提供范本，从而扩大天然小分子的应用范围。

然而，要进一步深化天然小分子化合物的临床应用，需要解决以下问题。首先，目前的研究多集中在天然小分子化合物在细胞水平和分子水平的体外影响，而体内研究较少，后期需要更多的体内实验来加以验证，为小分子化合物联合MSCs在骨组织工程的临床应用奠定基础。其次，目前天然小分子化合物影响MSCs成骨分化的分子机制的研究主要集中于BMP、MAPK或Wnt等少数几条信号通路，是否存在其他信号通路，各信号通路间交互的作用机制，以及不同MSCs成骨分化分子机制间差异的原因都值得进一步研究。最后，天然小分子化合物和干细胞在组织工程应用中的标准化问题目前研究尚不足，尚未建立有效的标准化操作技术体系，加之各大医院治疗水平不平衡，导致其临床应用受限，因此需要完善标准化的技术体系和加强以干细胞移植为核心的再生医学在治疗骨缺损修复方案及评估的标准化管理。总之，天然小分子化合物在骨骼系统疾病中更深层次地应用，还需继续寻找具有成骨诱导活性的新型天然小分子，并持续研究其构效关系等。