论文DOI：10.1002/adfm.201906128
本文的中心思想是通过提高化学反应速率增强化学动力治疗肿瘤效果。我们采用肿瘤细胞膜包裹表面负载葡萄糖氧化酶（GOD）的超小硒化亚铜（Cu2-xSe）纳米颗粒，利用肿瘤细胞膜的同源靶向性增加纳米颗粒在肿瘤内的富集量及滞留时间，通过 Cu2-xSe 表面的 GOD 高效催化肿瘤部位的葡萄糖降解，增加肿瘤部位的过氧化氢（H2O2）含量，采用高灵敏的光声成像实时监控肿瘤部位 H2O2 和血氧饱和度（HbO2）的变化，并在 H2O2 浓度最大时进行近红外二区（NIR II）光照，大大提高了化学反应速率，产生大量的活性氧（ROS），取得了良好的治疗效果。
A. “缺陷”造就完美，“富含空位”的超小 Cu2-xSe 纳米催化剂纳米晶体中的空位不仅可以诱导产生新颖的光学、电学、磁学性质，而且空位的含量和种类决定了这些性质的强弱。在前期工作之中，我们构建了“富含空位”的超小纳米颗粒，“空位”使得纳米颗粒在近红外一区及二区（NIR I 及 NIR II）具有较强的吸收，可以将近红外光高效地转化为热，用于肿瘤的光声成像和光热治疗（Adv. Mater. 2016, 28, 8927–8936；Adv. Mater. 2016, 28, 5072–5079），此外，空位还为纳米颗粒的掺杂和多功能化提供了广阔空间（ACS Nano, 2017, 11, 5633-5645; Nanoscale, 2018, 10, 3130-3143）。
在“富含空位”的纳米材料中，超小 Cu2-xSe 纳米颗粒具有优异的生物可降解性和良好的生物相容性（Nano Lett, 2018, 18, 4985-4992）。在近红外光照下，Cu2-xSe 纳米颗粒可以与肿瘤内部 H2O2 和 O2 反应，通过电子转移和能量转移两种机理产生活性氧（ROS），实现光动力治疗肿瘤（Nanoscale, 2019, 11, 7600–7608; ACS Appl. Mater. Interfaces 2019, 11, 16367−16379）。在无光照的情况下，超小 Cu2-xSe 纳米颗粒可降解释放出大量的 Cu+ 离子（Nanoscale, 2019, 11, 11819-11829），与肿瘤内的 H2O2 通过类芬顿反应产生 O2 及 ROS，实现化学动力治疗肿瘤。在上述研究基础之上，我们希望通过提高产生及降解 H2O2 的化学反应速率，在肿瘤内部产生大量 ROS，诱导肿瘤细胞凋亡，实现肿瘤治疗。
B. 联手葡萄糖氧化酶，增加肿瘤部位 H2O2 含量由于葡萄糖氧化酶（GOD）可以高效地催化葡萄糖氧化，产生葡萄糖酸和 H2O2，因此我们将 GOD 负载在超小 Cu2-xSe 纳米颗粒表面，一方面利用 GOD 消耗肿瘤内的葡萄糖产生 H2O2，增加反应物浓度，另一方面利用葡萄糖酸促进超小 Cu2-xSe 纳米颗粒释放 Cu+ 离子，从而提高类芬顿反应速率，产生大量 ROS。如何将负载有 GOD 的 Cu2-xSe 纳米颗粒高效富集在肿瘤部位已成为提高反应速率的关键科学问题，然而简单地利用肿瘤的高透性和滞留效应（EPR）已经不能满足我们的需求。
为了增加负载 GOD 的 Cu2-xSe 纳米颗粒（CS-GOD）在肿瘤部位的富集，降低 GOD 对正常组织和细胞的损伤，我们采用肿瘤细胞膜包裹 CS-GOD 纳米颗粒得到 CS-GOD@CM，有效保护了正常组织。同时我们还利用肿瘤细胞膜的同源靶向性增加了纳米颗粒在肿瘤部位的富集，而且延长了滞留时间，为后续的化学动力治疗奠定基础。
D. 可视化地利用近红外二区（NIR II）光照提高化学反应速率
如反应式（1）（2）所示，GOD 催化葡萄糖氧化时需要消耗 O2 来产生 H2O2，而 Cu+ 离子与 H2O2 反应时又产生 O2，因此，H2O2 浓度和O2浓度成相反关系。我们利用光声成像监视肿瘤部位血氧饱和度（HbO2）的变化，间接反映肿瘤内部 H2O2 浓度的变化，并在 H2O2 浓度最高时，进行 NIR II 光照提高芬顿反应产生 ROS 的速率，增强肿瘤治疗效果。
产生 ROS 的反应速率严重制约着化学动力治疗肿瘤的效果，我们围绕化学动力治疗中反应速率低的关键科学问题，通过设计高性能的化学反应催化剂（CS-GOD纳米颗粒）、增加肿瘤部位反应物浓度（H2O2）、以及在 H2O2 浓度最高时进行NIR II光照，提高化学反应速率。此外，肿瘤部位 H2O2 浓度变化可以通过高灵敏的光声成像实时监控，确定 NIR II 光照的最佳时间窗口，使整个治疗过程可视化和可控性更强，有效地提高了肿瘤治疗效果。
如图一所示，我们提取了小鼠乳腺癌（4T1）细胞膜，用于包裹负载有 GOD 的超小 Cu2-xSe 纳米颗粒，透射电子显微镜证实细胞膜成功将纳米颗粒包裹，同时 SDS-PAGE 进一步证实在整个包裹过程，细胞膜上表达的蛋白并未受到影响，与不同细胞进行吞噬实验，4T1 细胞吞噬的纳米颗粒最多，验证了肿瘤细胞膜的同源靶向性。图1e-f 证实了 GOD 共价偶联到超小 Cu2-xSe 纳米颗粒表面后依旧保持较好的酶活性。▲图一：a）细胞膜包裹负载有 GOD 的超小 Cu2-xSe 纳米颗粒的示意图；b）透射电子显微镜；c) SDS-PAGE；d) 细胞吞噬；e-f）自由的 GOD 与负载在 Cu2-xSe 纳米颗粒上的 GOD 的酶活性表征.
如图二所示，包裹肿瘤细胞膜的纳米颗粒（CS-GOD@CM）可以将葡萄糖降解为羟基自由基，我们计算得出反应速率方程中的 Vmax and Km 分别为 7.0 × 10-8 M/s 和 4.22 mM。结果表明 CS-GOD@CM 纳米颗粒具有较好的葡萄糖降解能力，而且通过 NIR II 激光照射后，不论羟基自由基还是总的 ROS 都被显著地提高，证实了 NIR II 光照有效提高化学反应速率，增加自由基产量。
▲图二a）CS-GOD 纳米颗粒降解葡萄糖产生羟基自由基的示意图；b）NIR II 光照（1064 nm）加速芬顿反应的示意图；c，f）探究 CS-GOD@CM 纳米颗粒与葡萄糖反应速率；d，g）探究 NIR II 光照加速羟基自由基的产生情况；e，h）探究NIR II光照加速总活性氧（ROS）的产生情况。通过活体成像实验（图三）表明，与没有肿瘤细胞膜包裹的 CS-GOD 纳米颗粒相比，包裹肿瘤细胞膜的纳米颗粒在肿瘤部位富集量更多，滞留时间更长。而且肿瘤部位的 HbO2 变化表明尾静脉注射 CS-GOD@CM 纳米颗粒后，肿瘤部位氧气先减少后升高，间接证明肿瘤部位 H2O2 的浓度先增加后降低。因此，我们在肿瘤部位 H2O2 浓度最高时，对肿瘤进行 NIR II 光照，增加化学反应速率，产生大量自由基，杀伤肿瘤细胞。肿瘤组织免疫荧光染色也证实在 H2O2 浓度最高时进行 NIR II 光照可增加肿瘤部位的 ROS 产量。将 CS-GOD@CM 纳米颗粒用于治疗小鼠肿瘤的结果如图四所示，免疫荧光染色证实由于在肿瘤部位产生大量 ROS，造成肿瘤坏死，显著提高了小鼠成活率并抑制肿瘤肺转移。 ▲图三：a）血氧饱和度（HbO2）变化反映肿瘤部位H2O2浓度变化的示意图；b）光声成像探究 CS-GOD@CM 纳米颗粒在肿瘤部位的富集时间以及富集量；c）CS-GOD@CM 纳米颗粒引起肿瘤部位 HbO2 的变化情况；d）对 b，c 的量化分析；e）肿瘤内产生 ROS 的情况。
▲图四：a）治疗小鼠肿瘤的示意图；b）免疫荧光染色表征肿瘤部位血管生长因子以及肿瘤坏死情况；c-e）治疗过程中小鼠体重、肿瘤体积以及存活率的变化；f）肺部转移的肿瘤灶数量；g）肺部转移灶的 H&E 染色。我们巧妙地利用 GOD 催化葡萄糖氧化，消耗 O2 和产生 H2O2，以及超小 Cu2-xSe 纳米颗粒降解 H2O2 产生 O2 的特点，通过肿瘤细胞膜包裹负载 GOD 的超小 Cu2-xSe 纳米颗粒，利用肿瘤细胞膜的同源靶向性来增加纳米颗粒在肿瘤部位的富集量及滞留时间，从而增加肿瘤部位 H2O2 浓度，并通过高灵敏光声成像实时监控肿瘤部位HbO2 变化来间接表征肿瘤部位 H2O2 浓度变化。我们在肿瘤部位 H2O2 浓度最大时，利用穿透性较好的NIR II激光进行光照，增加化学反应速率，提高 ROS 产量，最终提高肿瘤治愈率，抑制肿瘤转移。本工作为可视化的肿瘤治疗提供了新思路。该课题前前后后做了一年多的时间，刚开始时希望利用 GOD 与肿瘤内葡萄糖反应增加 H2O2 浓度，然后与超小 Cu2-xSe 纳米颗粒反应产生大量 ROS 杀伤肿瘤，但后续研究发现裸露的 GOD 对正常组织的损伤较大。因此，我们想到利用肿瘤细胞膜将裸露的葡萄糖氧化酶包裹起来，不但可以减少 GOD 与正常组织的接触机会，降低毒副作用，而且还可以借助细胞膜的同源靶向性，增加纳米颗粒的富集量和延长滞留时间。正当我们沿着这个方向不断前行的过程中，发现与我们想法较为相似的文章逐渐发表。为了增加文章的创新性与意义，我们潜下心来研究目前相关报道与我们工作之间的不同点及其局限性，发现在相关报道中，并没有系统地研究如何通过提高化学反应速率来提高化学动力治疗肿瘤的效果，而且没有测定肿瘤内部 O2 与 H2O2 含量的变化过程。通过反复研究葡萄糖氧化和 H2O2 降解这两个过程，我们想到肿瘤部位的 O2 与 H2O2 含量变化是相反的，而且 O2 变化与 HbO2 变化是一致的。HbO2 的变化可以用高灵敏的光声成像实时监控，因此，我们通过光声成像监控 HbO2 的变化，间接反应 H2O2 和 O2 浓度的变化，确定肿瘤部位 H2O2 浓度最高时的时间点和对肿瘤进行NIR II光照的最佳时间窗口，然后进行 NIR II 光照，瞬间产生大量 ROS，获得最佳的杀伤肿瘤效果。这恰恰成为了我们文章的创新点。因此，我个人体会是，要在研究过程中不断追踪与自己相关的新文章，不断地问自己工作的创新性在哪里，如何做才更有意义，边做边调整。当然在这个过程中离不开我导师李桢教授的悉心指导、帮助与支持，还有实验室同学的宝贵意见，才让我有幸获得一点小小的收获。
苏州大学李桢教授: 苏州大学放射医学与防护学院特聘教授，博士生导师，入选中组部“青年千人计划”、江苏省“双创人才”、江苏省“特聘教授”、“洪堡”学者。2005 年博士毕业于中国科学院化学研究所，之后 9 年间先后在英国利物浦大学、德国锡根大学、澳大利亚昆士兰大学和澳大利亚卧龙岗大学工作，于 2014 年加入苏州大学放射医学与防护学院，开展多模态分子影像、纳米医学方面的相关研究。在相关领域发表 SCI 论文 130 余篇（其中影响因子超过 10 的有 40 余篇），论文被引 6900 余次，h-index=42。研究成果荣获北京市科学技术一等奖等奖励。目前参与或主持科技部纳米重点专项、基金委重大仪器研究项目、基金委面上项目、江苏省重点研发计划等。
目前评论：0