以往，酶一直被认为具有将特定底物催化成产物的专一功能，但随着研究的深入开展，近些年发现酶在不同环境下有可能被赋予独特功能而产生新的催化产物。本文通讯作者，美国普林斯顿大学Todd K. Hyster教授此前通过研究发现黄素酶被光激发后，其功能可转变为催化脱卤成烯反应(Nature, 2016)或脱乙酰基反应(Nature chemistry, 2018)。在本研究中，他发现了新的黄素酶被光激发后催化了自由基的环化反应。

传统的有机合成中，小分子化学试剂催化的自由基反应难以控制产物的立体构型，催化剂也一般不具备普适性。Todd K. Hyster教授根据之前对黄素酶光照脱卤的认知，巧妙地设计了底物分子，开发了酶催化的不对称自由基环化反应，即对具有底物宽泛性的黄素依赖的烯还原酶进行照射，致使底物分子(α-氯酰胺)先脱卤形成自由基，随后自由基进攻分子内的碳碳双键成环¹(Figure 1)。他设计的烯还原酶催化的自由基环化反应不仅具备立体选择性，还具有底物宽泛性的特点，突破了传统有机合成方法在自由基反应过程中的瓶颈。

Figure 1. 光照下，烯还原酶催化末端含烯的氯酰胺底物的脱氯成环反应

酶催化的自由基反应不仅具有精确的化学以及立体选择性，还具有操作简易以及可根据反应需要进行催化剂改造等特点，而光激发产生的自由基在有机合成中广泛应用，却在酶催化领域鲜有报道，目前能够直接利用光能进行催化反应的酶仅包括原叶绿素酸脂还原酶、脂肪酸光脱羧酶以及DNA光裂解酶等。作者前期研究黄素酶时发现光能可改变黄素酶原本的功能，报道过烟酰胺依赖的黄素酶在光照的条件下发挥脱卤素(Nature, 2016)和脱乙酰基(Nature chemistry, 2018)的作用。本次研究则选择了光照射黄素依赖的烯还原酶，如GluER, GluER-T36A, MorB-Y72F和LacER等，底物分子变为含烯键的氯酰胺，巧妙利用了光照脱卤形成自由基的过程，设计了兼具立体选择性和底物宽泛性的酶催化的不对称自由基成环反应。

在催化反应体系的设计过程中，作者首先对反应条件进行了摸索，确定了黄素依赖的烯还原酶催化不对称自由基成环反应的条件。包括底物(含烯键的氯酰胺)、光、烯还原酶，NADP⁺、葡萄糖和葡萄糖脱氢酶(GDH-105)等(Figure 2a)。为提高脱氯成环的反应，作者构建了烯还原酶的突变体GluER-T36A。晶体结构显示突变体GluER-T36A与野生蛋白GluER没有明显差异，但催化的脱氯成环反应效率确实得到了提高(Figure 2b)。另外，作者也尝试将酶替换为硫代硫酸钠，获得了相同的产物(Figure 2c)。

Figure 2. a) 通过一系列对照实验寻找酶反应条件；b) 突变体GluER-T36A提高了成环的效率，而不改变立体异构体产物的比例；c) 硫代硫酸钠也能催化同样的反应

作者进行了一系列底物的催化实验来测试这种反应的能力：首先对底物，即含烯键的氯酰胺末端侧链进行改造，测试反应对末端侧链的宽泛性，结果显示不同类型的末端基团(Figure 3a)，且不论末端取代基是否存在支链(Figure 3a)该反应都能进行，且产物具有立体控制性。特别的是，突变体和其他同源的烯还原酶虽然在结构上没有明显差异，但在催化效率和产物的立体控制上却有不同，这为有机合成的催化剂提供了更多选择。然后通过改变底物中氯原子和双键之间的碳原子数目，依次得到了5元(Figure 3a)、6元、7元和8元杂环的内酰胺产物(Figure 3b)。接着研究了底物末端基团的大小和芳香性对反应产物构型的影响，发现末端集团越大，反应产物的量向非对映异构体(dr)偏移，而当基团为芳香环时，反应产物的量向对映异构体(er)偏移，从而推测是末端基团的位阻效应控制了产物的立体构型，表现在产物中对映异构体(er)和非对映异构体(dr)的比例(Figure 3c)。为进一步理解该类反应对产物立体构型的控制提供了依据。

Figure 3. a) 不同末端基团的底物均能被催化成环；b) 可改变氯原子与双键之间的原子数目控制合成5元、6元、7元甚至8元杂环的内酰胺产物；c) 末端基团的位阻效应影响产物对映异构体与非对映异构体比例。

Todd K. Hyster教授还对催化机制进行了研究。通过开展对底物-酶-辅酶形成的电子受体-供体复合体施加特定波长的光照检测其吸收情况等试验，发现是还原型的FMN_hq直接把电子转移给底物，最终促成环化反应与烯键的还原(Figure 4A)。同时通过氘代标记确定了底物双键被还原时氢原子是FMN_hq所提供的(Figure 4B)。他推测该现象取决于氢原子转移和C-C键翻转的先后顺序，如果前者先于后者，则生成非对映异构体，否则生成对映异构体(Figure 4C)，从机制上进一步解释反应中对映异构体和非对映异构体产物比例的控制。

Figure 4. A) 光照试验表明FMN_hq直接把电子转移给底物；B) 氘代标记试验表明双键还原时，氢原子由FMN_hq提供；C) 氢原子转移和键翻转决定了产物的立体选择性。

本研究显示了利用酶对自由基进行催化具有巨大的潜力。烯还原酶在光照条件下催化的不对称自由基环化反应不仅具有立体控制性，且因对反应底物的纯度要求不高，可在细胞裂解液中行使功能，简化了合成条件和步骤。虽然同源蛋白都具有催化效果，但在底物的偏好性和催化效率上具有一定的差异，这为内酰胺环的合成提供了更多的反应路径选择。这类酶在自然界中广泛存在，对其进行定向进化可改变其催化效果预示着这类反应在兴趣分子合成研究中具有良好的前景。

Todd K. Hyster教授致力于开发新催化剂合成小分子化合物，如含氮类化合物的合成。传统的有机化学方法催化合成化合物具有诸多挑战，因此他的课题组另辟蹊径，通过寻找合适的生物酶来突破传统有机合成的瓶颈。对我们工作中解码黄素酶的生物学功能研究给予了很大的启发，对于新型药物分子设计合成具有重要意义。

文章信息：

1. Biegasiewicz, K. F.; Cooper, S. J.; Gao, X.; Oblinsky, D. G.; Kim, J. H.; Garfinkle, S. E.; Joyce, L. A.; Sandoval,B. A.; Scholes, G. D.; Hyster, T. K., Photoexcitation of flavoenzymes enables a stereoselective radical cyclization. Science  2019, 364, 1166-1169.