双活性位点人工金属酶实现1+1≫2的协同催化效果!

A+

研究背景

酶工程广泛应用于绿色生产工艺、诊断技术、治疗应用和生物医学等领域。定向进化和计算驱动的突变技术，通过调节底物专一性和提高酶的活性和稳定性来优化生物催化剂，促进酶工程的发展。在非催化蛋白支架中引入生物催化位点为此技术提供了新的机会。利用此技术构建的单活性位点人工酶催化的反应，其转化率可媲美天然酶。其中，人工金属酶（ArMs）的构建最引人注目，通过将催化活性强的有机金属络合物引入蛋白质中得到ArMs支架。

人工金属酶(Arms)发展历程

	20世纪70年代末(第1例)
Wilson和Whitesides将二磷酸铑生物素衍生物引入链霉亲和素支架。该非手性化学催化剂可用于α-乙酰氨基丙烯酸的手性加氢。然而，这项工作可能是由于催化性能令人失望，没有引起科学界的注意。（JACS DOI: 10.1021/ja00469a064）
	21世纪初
由于有机金属催化和蛋白质工程的发展，产生了大量的人工金属酶。尽管这类人工金属酶可催化水解、还原、氧化以及C–C和C–杂原子等反应，但它们的催化性能一直不如天然金属酶。（Science DOI: 10.1126/science.aah4427）
	2010-2015
Ward等人利用定向突变策略开发了数以千计的蛋白质变体，并选择了最活跃的一种能够催化细胞中的复分解反应。Roelfes等人开发了人工铜-联吡啶催化剂，通过在体内将金属结合、非天然氨基酸结合到蛋白质支架中，或通过创建与铜结合的人工活性位点，实现选择性Friedel-Crafts烷基化。（Nature 537, 661–665 (2013); Chem. Sci. 6, 770–776 (2015)）
尽管在将单个催化实体引入蛋白质支架方面进行了大量的努力，但在引入多个活性位点以及分析这类活性位点的催化优势这方面的研究十分罕见。
	2013年以后
构建两个血红素、Fe-S或铜位点的蛋白质支架；催化金属引入脂肪酶。虽然赋予级联反应的能力，但催化过程分两步进行，改变了反应条件，排除了协同效应。（Nat. Chem. Biol. 9, 826–833 (2013). Angew. Chem. Int. Ed. 54, 511–515 (2015)）
酶工程不仅可以从头开始创造活性位点，以接近扩散极限的速率催化已知的生物反应，而且还可以生成进行新的自然反应的非生物位点。然而，将多个活性位点工程化为单个蛋白支架的催化优势尚未确定。
	2019（本研究）
近日，西班牙高等科学研究理事会Manuel Ferrer教授、巴塞罗那超级计算中心Víctor Guallar教授、西班牙物理化学研究所Julia Sanz-Aparicio教授合作利用酶工程技术构建了一种具有两个生物/非生物起源的活性位点的人工金属酶，以改进天然和非天然催化作用。（图1）研究亮点：（1）该方法大大提高了含有两个活性位点酶的酶效率、底物范围、立体选择性和最佳温度窗口等催化性能。（2）将其中一个活性位点转化为金属络合物的化学催化位点，进行氧化和Friedel–Crafts烷基化反应，促进单一蛋白质中的协同化学和生物催化。（3）利用这种多功能金属酶，可将乙酸萘酯转化为1,4-萘醌（转化率约100%），将巴豆酸乙烯酯和苯转化为3-苯丁酸（转化率≥83%；e.e.>99.9%）。（4）该方法在制备具有改进的催化性能的生物催化剂方面，以及在制备生物和非生物催化实体协同作用下进行级联反应的金属酶方面，均具有巨大的潜力和通用性。

提出问题

酶工程可从头创造活性位点，而且还可以生成进行新的自然反应的非生物位点，因此，利用酶工程制备可媲美天然酶催化性能的人工酶具有重要意义。其中人工金属酶（Arms）由于其优异的催化性能备受关注。目前的研究集中于构建单一活性位点的Arms且催化性能不如天然酶。所以，研究人员提出构建多活性位点的Arms，这类设计虽然赋予Arms级联反应的能力，但催化过程是分两步进行，改变了反应条件，排除了协同效应。

研究思路

首先，利用酶工程技术构建具有两个活性位点的Arms，然后，通过理化性质表征Arms催化优势，最后，利用两个化学反应验证其协同催化优势。

研究过程

首先，构建具有两个活性位点的Arms（如图1所示）。

1）选择含有生物活性位点（生物位点1）的目标天然酶（如EH1_A1）。

2）通过应用蛋白质能量景观探索（PELE）软件确定另一个结合袋，利用酶工程技术引入一个人工生物活性位点（如EH1_B1），结合袋可以被进一步改造以获得最佳配置（生物位点2），得到EH1_AB1_。

3）通过对含有金属-有机络合物的自杀性膦酸盐抑制剂亲和力的差异，一个生物位点被转化为铜基化学催化位点（化学位点），而另一个位点保留其生物活性（生物位点），得到最终的金属酶(EH1_AB1C-B)_。

然后，通过理化性质表征Arms的催化优势。

1）具有两个生物活性位点的生物催化优势

通过将第二活性位点EH1_B1引入天然酶EH1_A1中，利用反应常数（k_cat）、催化效率（k_cat/Km）、立体选择性（e.e.）、酶的最佳活性温度等指标来判断EH1_B1的引入是否增强EH1_A1的催化性能。EH1_B1与EH1_A1结合增加了k_cat（平均约3.4倍；最大约74倍）和k_cat/Km（平均约94倍；最大约5000倍）酯水解值（图2a-2b），立体选择性增加约1100倍（e.e.>99.9%）(图2c)，并使酶保持其最佳活性80%以上的温度增加约20℃(图2d)。结果表明，在特异性、亲和力、转化率和局部稳定性方面，EH1_B1的引入显著增强天然酶的原始生物催化特性。

2）EH1_AB1的晶体结构

为了证明EH1_AB1的两个活性位点都能够与底物结合，并且可以在两个位点发生转化，作者EH1_AB1进行了结构分析。从EH1_AB1获得了分辨率为2.1Å的晶体。这些晶体与抑制剂4-硝基苯基己基膦酸甲酯（M4-4NHP）共结晶得到相应的衍生物络合物，抑制剂的两个分子与催化丝氨酸残基Ser161（原始亲核剂）和Ser211（人工亲核剂）结合（图3a）。所求解的三维结构在含有两个N末端螺旋区域显示出高度的灵活性，这两个N末端螺旋基序允许进入活性位点口袋。如图3b所示，在抑制剂结合后，在二级Ser211催化位点（人工重塑位点）观察到构象变化，这将扭曲浸透晶体内的排列。结合到两个位点的抑制剂的原子相互作用可以被描绘并且显示在图3c-f中。（自由晶体(c,e)和复合晶体(d,f)中Ser161和Ser211结合位点的原子相互作用的细节）

3）EH1_A1、EH1_B1和EH1_AB1均能与Cu-SI紧密结合。

作者发现天然酶（Ser161）和人工酶（Ser211）均能与M4-4NHP抑制剂结合，因为不到10分钟，用过量SI处理EH1_A1、EH1_B1和EH1_AB1可导致>99%的酶失活。随后作者合成过渡金属螯合M4-4NHP的自杀抑制剂（Cu-SI），赋予缓蚀剂单元过渡金属催化功能，成为亚酶的两个活性位点之一，而另一个保持完整。为了验证这种生物结合，将SI修饰的亚酶与过量的Cu（NO₃）₂孵育24小时，然后透析去除未偶联的抑制剂和铜，并通过UV-Vis进行分析。在UV-Vis光谱中观察到，EH1_A1-SI、EH1_B1-SI、EH1_AB1-SI在386nm处存在λ_max（图4a）这是Cu²⁺联吡啶络合物的特征（图4b）；在没有Cu²⁺的情况下，没有检测到蛋白质的这种信号（图4a）。除了UV-Vis光谱分析，还对Cu²⁺有机配合物的氧化还原性质和ESI-MS对其进行了分析。结果表明，天然酶（Ser161）和人工酶（Ser211）均能与M4-4NHP抑制剂（SI）紧密结合。

最后，利用两个化学反应验证其协同催化优势。

1）EH1_AB1C-B及其在两个模型反应中的应用。

EH1_AB1C-B的催化活性是通过酯的酶解反应和双吡啶铜氧化反应(图a)或Friedel-Crafts烷基化反应(图b)两种级联反应来评估。由于酯1的高转化率和双吡啶铜的电子转移能力，作者选择了这两个反应作为第一个级联反应。在图a中，酯1的酶解产生醇2，而醇2可能被双吡啶铜催化剂氧化为醌3。双吡啶铜催化剂已被证明可以进行Friedel-Crafts烷基化反应，同时，酯4在人工位点容易转化，由此产生的水解产物可以与苯偶联，所以选择了这两个反应作为第二个级联反应。在图b中，酶水解的酯4将生成烯基脂肪酸5、酸5与苯6产生酸7。