背景介绍

酶是催化化学反应的高效催化剂。DNA技术和生物信息学的发展开发出很多合成化学品和药物的天然酶。然而，多数生物催化剂来源于常温微生物，不能耐受苛刻的工业反应条件如高温等(但提高反应温度不仅可以加快反应速率，还可以提高疏水底物的溶解度)。内在原因导致酶在实际操作条件会快速失活，限制了其工业应用。为解决这个问题开发出不少有效策略，如挖掘嗜热酶，对酶进行化学修饰和酶的固定化。

此外，蛋白质工程是改进酶催化性能的有效工具。在过去几十年有很多成功的例子。例如，通过蛋白质工程可开发的新型酶可以催化天然生物催化剂不能催化的反应，一些工程酶已应用在工业合成药物化合无的中间体，如西他列汀(捷诺维)、阿托伐他汀(立普妥)和孟鲁司特(顺尔宁)。生物化学家对酶的热稳定化非常感兴趣，开发出很多不同的改造策略和高效的酶。大部分情况下，热稳定性的进化对酶活性有微弱的影响，因为突变主要位于蛋白表面，远离活性中心。然而，由于常见的稳定性-活性权衡，同时提高酶的热稳定性和活性是非常有挑战性的，尤其是当突变靠近活性中心时。因此，迫切需要开发有效的蛋白质工程策略同时提高蛋白热稳定性和活性。

本文尝试利用定向进化和突变作用的加和性和协同性同时提高Lactobacillus brevis羰基还原酶LbCR的热稳定性和活性获得高效的突变体。突变体晶体结构分析表明突变残基主要位于靠近活性中心的灵活loop上。使用共表达LbCRM8和BmGDH基因的E. coli作为催化剂，我们成功实现了大规模反应制备阿托伐他汀前体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。

图文解析

A. 组合突变同时提高热稳定性和活性

前期研究结果表明，来源于短乳杆菌L. brevis的羰基还原酶LbCR，在酶促合成阿托伐他汀前体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯(ATS-7)中表现出优异的立体选择性。但是较差的热稳定性和中等的活性限制了其在工业上的应用。

我们首先通过易错PCR的方式分别获得了三个热稳定性提高的突变体(表1)，分别是LbCRM0(M154I)，LbCRM1 (A155D)和LbCRM2 (V198I)。经过DNA shuffling后获得热稳定性显著提高的突变体LbCRM4 (M154I/A155D)，其在40°C下的半衰期由2.5min延长至1070 min，比母本LbCRWT提高了430倍，但是对底物ATS-6的亲和性却显著降低，导致催化效率kcat/KM的降低。这体现了定向进化中酶的稳定性和功能的权衡。

活性的定向进化获得了一个催化效率提高2.5倍的突变体LbCRM3 (A201D/A202L)，但同时其热稳定性也有所降低(表1)。上述这些结果充分体现了酶的进化过程中活性和稳定性的权衡问题。为了解决这个问题，通常会选择将这些“热点”进行组合。利用突变作用的可加和性和协同性，可以同时提高多种特性。该策略成功应用于同时改造不相冲突的热稳定性和对映选择性，或活性和对映选择性，但很少报道用于同时改造热稳定性和活性。

为了同时提高热稳定性和活性，我们尝试组合提高活性的突变A201D/A202L和提高热稳定性的突变M154I/A155D和V198I。令人兴奋的是，拥有M154I/A155D/A201D/A202L突变的组合突变体LbCRM6和拥有M154I/A155D/A201D/A202L/V198I突变的组合突变体LbCRM8的热稳定性和活性同时得到了提高(表1)。其中最优突变体LbCRM8在40°C下的半衰期由几分钟延长至3天多，是母本的1944倍，催化效率kcat/KM提高了3.2倍。这些结果表明尽管稳定性和活性存在权衡，利用突变作用的加和性和协同性仍然可以同时提高酶的热稳定性和活性。

      为了进一步验证热稳定性，我们又考察了突变体的Tm和，它们分别代表了酶的热动力学稳定性和动力学稳定性。如图1A所示，LbCRM6和LbCRM8的T1550分别比母本提高了18°C和20°C。圆二色光谱分析表明LbCRM6和LbCRM8的Tm分别比母本提高了7.8°C和7.0°C (图1B)。

Figure 1. Thermal inactivation/unfolding analysis of purified wild-type LbCRWT and its variants. A,  of WT and engineered mutants. B, Thermal unfolding curves of WT and variantenzymes measured using circular dichroism spectroscopy.

B.  阐释热稳定性增强的机制

为了探索热稳定性显著增强的机制，我们尝试解析LbCRWT，LbCRM6和LbCRM8的晶体结构。最终我们获得了LbCRM6和LbCRM8的apo晶体结构，分辨率分别为2.0和2.3 Å。不幸的是，我们没有得到母本WT的晶体，可能是由于其稳定性较差的原因。因此我们以LbCRM8的晶体结构作为模板对LbCRWT进行同源建模。

基于突变体的空间结构我们发现突变主要位于活性中心周围的loops上。通过比较LbCRWT的结构模型和LbCRM8的空间结构，我们发现LbCRM8的Asp155分别和loop7的Val96和α5螺旋上的Ala157和Tyr158形成了三个新的氢键。这些新形成的氢键提高了活性中心周围灵活loop7和loop9的稳定性。有意思的是，Li等发现嗜热酶经过定向进化在室温下活性显著提高的主要原因是突变导致活性中心周围的刚性loop变的更灵活了。这两个结果是相关的，都表明了活性中心loop对酶稳定性的重要性。另外，其他的突变则通过增强了蛋白内部疏水作用和加长了α6螺旋等方式提高loop11的刚性。

Figure 2. Locations of mutations (ball and stick representations) in the monomer structure of LbCRM8 (M154I/A155D/A201D/A202L/V198I). Active site residues are shown as orange sticks.

Figure 3. Structural comparison of mutations in LbCRWT (A and C) and LbCRM8 (B and D). A and B, Analysis of the mutation of residues 154 and 155. Mutated residues are shown as magenta stick, mutation site, and dotted line indicate hydrogen bonds. C and D, Analysis of the mutation of residues 198, 201, and 202. Hydrophobic interactions are shown as a lightpink surface, and dotted line depict hydrogen bonds.

C. 阐释活性增强的机制

为了阐释突变A201D/A202L对酶活性的影响，我们利用软件AutoDock将底物ATS-6对接到LbCRWT，LbCRM3和LbCRM8的活性口袋中。对接结果显示，底物的羰基氧分别和Ser145和Tyr158的羟基形成氢键，羰基碳的si-面受到NADPH烟酰胺环C4上的H攻击生成相应的(R)-醇，与实验结果一致。底物在LbCRWT，LbCRM3和LbCRM8活性口袋的结合取向近似。尽管突变A201D/A202L跟底物没有直接的相互作用力，但是这些突变却导致底物跟残基Ser145，A147和G148之间形成了新的氢键。这些新的作用力提高了酶对底物的亲和性，与降低的KM一致。因此，突变A201D/A202L对酶活性提高的贡献是稳定蛋白底物之间的结合作用力。

此外，提高活性的突变A201D/A202L和提高热稳定性的突变M154I/A155D的加和性导致LbCRM6热稳定性和活性的同时提高。这可能是由于这两种突变位于两个独立的区域(>10Å)，相互之间没有明显的作用力，正如基因V蛋白(GVP)经过组合突变同时提高了稳定性和DNA结合亲和性。另外，V198I与A201D/A202L之间的协同作用进一步提高了LbCRM8的热稳定性，同时略降低了活性。

D. 不对称还原大位阻β-酮酯ATS-6合成ATS-7 

我们将突变体LbCRM8和用于辅酶NADPH再生的Bacillus megaterium葡萄糖脱氢酶BmGDHQ252L应用于不对称还原酮酯底物ATS-6合成ATS-7的反应中。然而，我们发现突变导致LbCRM6和LbCRM8可溶性表达水平的降低。为此，我们尝试了不同的融合标签和表达宿主提高突变体的可溶性表达。最终发现LbCRM6和LbCRM8在E. coli Rosetta–gami 2 (DE3)/pET28a表达体系的可溶性表达水平有所提高，达到母本的水平。

鉴于突变体LbCRM8在40°C稳定性的提高，我们将反应温度由30°C提升至40°C。相同反应条件下，LbCRM8可以在4 h内完全转化底物，而母本LbCRWT在13 h后也只能转化26%的底物，这可能是由于母本LbCRWT在反应时间内快速失活而LbCRM8基本保持了其初始活性。

另外，通过在E. coli细胞内共表达LbCRM8和BmGDHQ252L不仅降低了催化剂的添加量，还进一步提高了蛋白的可溶性表达水平。仅用1 g L−1的冻干细胞就可在8 h内完全转化300 g L−1的底物，立体选择性>99.5%。最终该反应成功放大到100 mL规模，底物/催化剂比率达300 g/g，产品分离得率87%，时空产率达到1050 g L−1d−1，是目前报道的酶促反应合成ATS-7的最高水平，表明了该生物反应在合成手性阿托伐他汀前体ATS-7的技术竞争性和经济可行性。

Figure 4. Asymmetric reduction of ATS-6 by E. coli cells coexpressing LbCRM8 and BmGDH to synthesize atorvastatin intermediate ATS-7 at 100 mL scale.

论文总结

利用定向进化和组合突变，本研究成功获得稳定性和活性同时提高的突变体。鉴于稳定性和活性权衡现象，同时获得这两种特性的改进是比较引人注目的。突变体晶体结构的分析表明突变引入了新的氢键并提高了蛋白内部疏水作用力从而提高了活性口袋周围灵活loop的刚性。最重要的是，最优突变体LbCRM8可以在高温下不对称还原ATS-6生成ATS-7。最终反应时空产率达到1050 g L−1d−1，底物/催化剂比率达300 g/g，表明LbCRM8在阿托伐他汀高级手性中间体ATS-7实际生产中的应用潜力。

注：文章的第一作者是华东理工大学的在读博士生宫绪敏，通讯作者是郑高伟副教授和许建和教授，工作得到了国家自然科学基金(Nos.21536004, 21871085 & 31500592)的支持。

作者介绍

许建和，教授、博士生导师，现为华东理工大学长江学者特聘教授(2009-2012)、全国优秀教师、上海市领军人才。