给大家分享一篇发表在JACS上的文章，标题是“Chemically Acylated tRNAs are Functional in Zebrafish Embryos”。本文的通讯作者是来自爱荷华大学的Christopher A. Ahern教授和来自匹兹堡大学的Alexander Deiters教授。Ahern课题组的研究主要关注电压门控钠通道的功能和药理学以及化学生物学方法在电压门控通道研究中的一般应用。Deiters课题组主要关注生物活性小分子的合成与开发。

作为较为成熟的遗传密码拓展方法，非天然氨基酸插入技术已被广泛应用于引入光笼、生物正交手柄和光交联剂等官能团，以实现蛋白质的功能化。非天然氨基酸插入技术的核心在于，通过引入识别非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶/tRNA正交对，将非天然氨基酸插入到琥珀密码子位点（amber stop codon）。

目前，非天然正交对的开发及相关技术的进展已经实现了不同结构及功能的非天然氨基酸（UAAs）在原核细胞、真核细胞以及动物蛋白质中的成功插入。在插入的过程中，UAAs的大小和结构复杂性主要受到氨酰-tRNA合成酶结合口袋的限制。tRNA与UAAs直接化学酰基化绕过合成酶有助于克服这一限制。化学酰化tRNA并在体外将UAA掺入蛋白质中的应用在1989年由Schultz课题组首次报道。相较于体外而言，在细胞中应用该技术受到的限制主要来源于酰基化tRNA的递送问题。卵母细胞的显微注射可以克服上述障碍，然而，在已有的报道中，使用的卵母细胞都是未受精的，一定程度上表明了系统和生物学研究的复杂性。

在本文中，作者首次证明了将化学酰化的tRNA注射到受精的斑马鱼卵母细胞中会导致胚胎发育过程中UAAs与蛋白质的结合，这与该模式生物中的酶遗传密码拓展相当。此外，作者利用直接化学酰化来引入光笼组氨酸并展示了在斑马鱼胚胎中表达的不同酶中不同组氨酸功能的光学控制。作者将蛋白质置于光笼UAAs的光学控制下，并在早期发育期间提高了斑马鱼胚胎的透明度，使蛋白质功能通过短暂的光照激活。

首先，作者验证了该方法的可行性，测试了在发育的胚胎中注射化学酰化的tRNA在琥珀密码子上的插入效率以及蛋白的表达量（图1A）。

作者选择的tRNA是来自古生菌Methanosarcina barkeri (PylT)的吡咯酰tRNA，此前已被证明与斑马鱼内源性的合成酶正交，排除了合成酶酰化带来的非天然氨基酸插入的干扰。作者选择的非天然氨基酸是Alloc-lysine(AllocK, 图1B)。在进行相关的合成之后，作者使用Renilla荧光素酶报告基因评估AllocK的插入效率，表面残基突变为琥珀终止密码子(rLuc L95TAG，图1C)。注射后，胚胎在28.5 ℃下孵育，并在受精后8、24、48和72 h(hpf)收集裂解物，随后检测荧光素酶表达情况(图1D,E)。未酰化的PylT注射液未显示出显著的荧光素酶活性，验证了tRNA的生物正交性。尽管动物体内化学酰化的tRNA插入效率较低，但PylT^AllocK注射液表达的蛋白水平较高，一定程度上帮助了后续实验的开展。对于该报告蛋白而言，蛋白质产量在8 hpf达到峰值，一直持续到72 hpf。这种短暂的表达过程可能与注射的mRNA和PylT随时间的衰减以及荧光素酶蛋白的短半衰期(在哺乳动物细胞中约4 h)有关。两种方法的主要区别在于，在合成酶和tRNA的生命周期内，PylT的酶酰基化可以持续进行，而化学酰化途径引入的则是固定数量的酰化PylT。因此，作者预计化学酰化的PylT会产生更少的蛋白质。作者还评估了化学酰化PylT抑制同一转录本中多个终止密码子(V47TAG和V70TAG)的能力。结果表明，与单一的琥珀密码子抑制相比，蛋白质水平显著降低，但它与通过tRNA合成酶表达的遗传密码拓展技术一样有效。

总之，通过化学酰化UAAs使其连接PylT是一种在斑马鱼胚胎中位点特异性插入UAAs的可行办法。

图1. 化学酰化的tRNAs在斑马鱼胚胎中有功能，并使UAAs特异地插入到蛋白质中

图2. 化学酰化PylT光笼组氨酸的引入和酶功能的光激活

在验证了化学酰化插入的可行性后，作者测试了NPH在胚胎中光控蛋白质功能的能力。

用rLuc L95TAG报告蛋白评估NPH酰化的pylT与斑马鱼胚胎蛋白质的结合，结果表明，在24 hpf下收集胚胎裂解物，发光读数显示明显高于背景(图2B)，但低于AllocK。在进一步的测试中，作者将rLuc的285号位点的H突变为琥珀密码子TAG（图2C），该位点位于活性口袋中，主要负责与腔肠素形成氢键。与野生型酶相比，该位点的突变仍保留了11%的活性，作者怀疑NPOM基团的额外空间结构不仅阻断了氢键，而且进一步破坏了底物结合。在红光滤光器下注射PylT^NPH和rLuc H285UAG mRNA，胚胎在黑暗中孵育，以消除NPH背景脱除的任何可能性。在24 hpf下，用405 nm的LED照射表达rLuc 285NPH的活胚胎，然后进行裂解和发光读出。辐照样品的酶活性比未辐照样品增加了约6倍(图2D)。非辐照条件下，rLuc活性高于−AA背景，可能与上述285号位点的突变耐受性有关。接下来进行了辐照时间依赖实验，结果表明酶的功能可以通过照射时间进行调整，rLuc活性在光照1分钟后趋于稳定。超过NPH完全脱除所需时间的延长照射导致荧光素酶活性下降，可能是酶的光降解导致的。

随后，作者进一步验证了NPH与斑马鱼胚胎中的蛋白质结合产生光笼酶的能力。

为了实现这一目的，作者选取Cre重组酶作为研究底物。该酶的活性位点有一个保守的组氨酸残基(H289)，虽然不直接参与催化，但其在DNA结合位点的位置和亲核酪氨酸Y324接近，突变将带来一定的活性损失(图3A)。将H289TAG突变体与PylT^NPH共注射到Cre重组酶报告基因的转基因鱼系中。胚胎表达泛素启动子下的loxP位点两侧的EGFP。Cre重组酶重组后，EGFP及其终止密码子被移除，mCherry表达(图3B)。表达Cre重组酶289NPH (Cre-NPH)的胚胎在5 hpf下用405 nm光照射来进行酶的激活，并在48 hpf下成像(图3C)。作者选择在5 hpf照射，以便有足够的时间表达光笼的Cre重组酶，同时在早期激活Cre重组酶，此时mCherry全胚表达所需的重组事件较少。该时间点的选择主要基于PylRS介导的笼状氨基酸掺入的早期结果。

未注射的胚胎EGFP荧光较亮，未检测到mCherry，而野生型Cre重组酶表达条件下，mCherry荧光较强，未检测到EGFP，验证了该方法的可行性。Cre-NPH的表达与未注射的胚胎具有相似的荧光模式，光激活表达Cre-NPH的胚胎显示出良好的mCherry荧光。这表明，在光照下，Cre-NPH具有极好的激活作用，而在未辐照的样品中，背景活性极低，证明了胚胎中NPH的稳定性及其易脱笼的良好性能。

值得注意的是，在辐照后，PylT^NPH分解为PylT^His，并且仍然可以在琥珀密码子处插入。因此，直到PylT^His被消耗完或降解完为止都可以检测到有活性的酶的表达。且，因为光脱笼的不可逆、快速（比蛋白质翻译快得多），作者认为光脱笼不会影响蛋白质功能的时间分辨研究。

此外，作者试图通过将NPH掺入HCVp来提出一种光学控制蛋白酶功能的通用方法，并首次证明了其在水生胚胎中的光激活。

HCVp是来自丙型肝炎病毒(HCVp)的单链变异病毒蛋白酶(图4A,B)。此前的研究中，HCVp在光控下使用Dronpa结构域或PhoCl结构域在哺乳动物细胞中成功实现了蛋白切割，可以用于选择性地降解蛋白质或通过去除信号肽来控制蛋白质的定位。然而，这些方法需要融合蛋白结构域或抑制剂链，难以推广应用。

作者首次证明了HCVp H57NPH (HCVp-NPH)突变体在斑马鱼中表达。在24 hpf下，无PylT^NPH时，anti-HA western blot显示蛋白表达良好，琥珀密码子无背景抑制(图4C)。为了检测HCVp的活性，作者采用了荧光膜易位报告蛋白(mCherry- caax)，其HCVp切割位点位于膜锚点和mCherry之间(图4D)。成像和辐照实验在24 hpf的条件下进行，在这一条件下，报告蛋白的表达量最高，同时，器官成像最为清晰。

在24 hpf下，用405 nm光照射表达HCVp-NPH的胚胎，然后在28.5 ℃下孵育3 h。在24 hpf下对胚胎大脑区域进行成像，并在不同条件下测量mCherry荧光的细胞质-膜比(C/M)(图4E,F)。选择大脑成像，是因为在一个共焦平面内可成像的细胞密度较高，且报告基因表达丰富，亚细胞定位合适。仅注射报告基因时，结果表明mCherry与质膜高度分离，而野生型HCVp表达结果为mCherry在整个细胞中均匀分布，验证了HCVp活性的测定方法。光笼HCVp-NPH的表达结果为，mCherry在膜上的定位与仅注射报告基因的对照组相似。并且，在辐照胚胎中，荧光分布与野生型HCVp相似，验证了通过405 nm照射的蛋白酶功能的光学开关。

图4. 斑马鱼胚胎蛋白酶功能的光学控制

为了进一步评估光学控制蛋白酶活性在斑马鱼胚胎中的稳定性，作者重复了实验并对胚胎眼睛进行成像，结果显示野生型蛋白酶表达和辐照HCVp-NPH胚胎有类似的亚细胞分布，而未辐照的胚胎主要是膜定位荧光。

总的来说，作者证明了PylT的化学酰化是一种将非天然氨基酸(UAAs)引入斑马鱼胚胎蛋白质中的可行方法，为设计、合成和应用具有新结构和新功能的UAAs提供了可能性。通过化学酰化方法回避氨酰-tRNA合成酶的限制，大大扩展了UAAs的效用和库的规模，作者期望将这种方法转化为一种可以应用于人类发育和疾病发育的脊椎动物模型，以期研究广泛的生物过程。

本文作者：LD

原文引用：https://doi.org/10.1021/jacs.2c11452

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