推荐一篇发表在Metabolic Engineering上的文章，文章标题是“Biosynthesis of β-lactam nuclei in yeast”。其通讯作者是来自中国科学院天津工业生物技术研究所的孙周通研究员，他们课题组围绕酶定向设计方法的研究与酶底物结合口袋的再设计与催化机制的解析，针对天然生物酶存在诸如催化效率低、立体选择/区域选择性较差、底物谱窄、热稳定性差及催化机制不清楚等问题。基于生物信息学与计算设计进行新型工业用酶挖掘设计与再设计，结合分子定向进化改造及计算机(in silico)辅助设计与筛选。本文中，建立了一个能够通过结合天然酶和人工酶合成多个β-内酰胺核酿酒酵母，作为生产有价值的β-内酰胺中间体和新型抗生素的代谢工具。

本文将酿酒酵母设计为从单糖开始合成多种β-内酰胺核的通用平台，从而使人们能够随时获得许多具有重要药学意义的结构不同的抗生素。近年来，β-内酰胺核的生物合成备受关注，而合理设计非天然抗生素产生微生物以产生β-内酰胺核仍然具有挑战性。受益于异源生物合成途径的整合和合理设计的催化水解酶从头开始的通用平台和扩环反应，作者成功构建了合成酵母细胞工厂，生产抗生素头孢菌素 C (CPC, 170.1 ± 4.9 μg/g DCW) 和下游的β-内酰胺核，包括 6-氨基青霉酸 (6-APA, 5.3 ± 0.2 mg/g DCW)、7-氨基头孢菌素酸 (7-ACA, 6.2 ± 1.1 μg/g DCW) 以及 7-氨基脱乙酰氧基头孢菌素酸 (7-ADCA, 1.7 ± 0.1 mg/g DCW)。这项工作建立了一个能够通过结合天然酶和人工酶来合成多个β-内酰胺核的平台，该平台可作为生产有价值的β-内酰胺中间体和新抗生素的代谢工具。

图1 酿酒酵母中ACV和 CPC 的体内合成

酵母中 CPC的设计生物合成途径由两个模块 I 和 II 组成；模块 I 中，三种简单的前体，包括 L-缬氨酸、L-半胱氨酸和 L-α-氨基己二酸，在消耗三个 ATP 分子催化 ACV 合成酶。模块 II 中，ACV 三肽环化为异青霉素 N (IPN)，然后通过 IPN合酶异构化为青霉素 N (PN)(IPNS) 和 IPN 差向异构酶 (IPNE)。此后，中间体 PN 在双功能酶 DAOC/DAC 合酶 (DAOC/DACS) 的催化下依次转化为脱乙酰氧基头孢菌素 C (DAOC) 和脱乙酰头孢菌素 C (DAC)。在乙酰辅酶 A：DAC O -乙酰转移酶 (DAC-AT) 催化的 DAC 乙酰化后，完成了 CPC 生物合成的最后一步。作者分别对模块II中的CPC合成通路中的4个酶的编码基因（pcbC, cefD, cefEF, cefG）分别进行了不同物种来源的筛选和优化得到了CPC产量最高的工程菌株DM75。

图2 在酵母中完成7-ACA 的生物合成

接下来作者通过模块III中的CPC 酰基转移酶（CPCA）来催化CPC到7-ACA的合成，鉴于CPCA的低催化效率，作者对其进行了蛋白质工程改造，首先作者找到了表现出最高酰化活性的假单胞菌属的突变体 S12然后对其分别进行了174个氨基酸和193个氨基酸的突变分别得到突变体E742和E743。然后分别用S12,E742,E743全细胞催化CPC到7-ACA的生物合成，发现产物只能在破碎细胞中检测得到，说明宿主菌株无法将7-ACA分泌到培养基中，其中菌株DM260（E743突变体）相较于原始菌株DM258（S12突变体）产量有15.7%的增加；然后将以上三个突变基因分别整合到已经得到的产生CPC的菌株DM75中来从头合成7-ACA，我们发现与菌株DM293（DM75+E742）与原始菌株DM292（DN75+S12）相比产量增加了51.2%。

图3 在酿酒酵母中通过重组途径从头生物合成6-APA

作者接下来用模块IV中的IPN酰基转移酶（AT）作为催化剂将模块I产生的IPN转化为6-APA。作者用不同来源的ACVS基因和去除终止密码子的方法来优化ACV的合成，ACV的产量得到了140.9%的提升。随后作者将来自产黄顶孢霉的pcbC构建到菌株DM531中，随后分别评估了来源于黄青霉和构巢曲霉的penDE，最终得到了DM268（来源于构巢曲霉的penDE）达到了5.3 ± 0.2 mg/g DCW (11.3 ± 0.5 mg/L) 的 6-APA产量。

图4 使用工程化 DAOCS 在一步反应中产生 7-ADCA 的人工途径

脱乙酰氧基头孢菌素 C 合酶 (DAOCS) 是环氧化青霉素 N 形成头孢菌素六价噻嗪环的关键酶，青霉素N的类似物6-APA 可能被 DAOCS 接受。因为目前还没有报道可以将 6-APA 转化为 7-ADCA 的酶，作者将来自Streptomyces clavuligerus ( Sc DAOCS) 的突变体 H7能够将6-APA催化为7-ADCA的突变体，因此作者接下来将H7作为蛋白质工程的起点选择了21个氨基酸残基作为备选突变位点，其中11个位点是通过分子对接得到，另外10个位点是其他研究小组的研究热点位点。在通过迭代饱和突变以后最终得到了最好的突变体 A61E/F225L 与起始模板 H7 相比提高了 6.2 倍。最终我们将设计的模块 V 中工程化的Sc DAOCS A61E/F225L添加到产生 6-APA 的平台菌株 (DM268) 中，得到的菌株 DM280 在发酵 9 天后达到 1.7 ± 0.1 mg/g DCW (5.3 ± 0.3 mg/L) 的 7-ADCA 终浓度。

这项工作代表了抗生素 CPC 和 β-内酰胺核（包括 7-ACA、6-APA 和 7-ADCA）在异源宿主中通过使用单糖作为碳源的从头生物合成。这项工作代表了使用酵母生产 CPC 和 β-内酰胺核的潜力。进一步应用菌株改良和放大技术可能会提高 CPC 和 β-内酰胺核产量。然而，目前的工作开辟了使用酵母作为细胞工厂生产 β-内酰胺抗生素的可能性。

文章作者：WSJ

原文引用/DOI：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2021.10.013

责任编辑：LD