酰基转移酶

通路到两个（2 - [R ）-和（2 小号）methymalonyl辅酶A的异构体在细菌细胞中存在，因此，在原则上，在最终的聚酮化合物的产品观测到甲基配置可能AT结构域通过明智地选择出现由PKS一种或另一种对映体。关于聚酮化合物生物合成中扩链单元选择的第一个信息是在20世纪80年代中期通过将同位素标记的前体进料到红霉素生产者红色糖酵母的全细胞中提供的，导致产生同位素标记的（2R） - 和（2）S） - 甲基丙二酰辅酶A原位[23]。当（2S） - 甲基丙二酰基-CoA 的前体时，[2- 2 H.2，2- 13 C]丙酸酯中，使用由差异产品的分析13 C {1 1 H，2H} NMR在C-2，C-4，和大环内酯环的C-10提供了证据为同位素标记。该结果与在第二，第五和第六链延伸循环期间掺入（2S） - 甲基丙二酰基-CoA 一致，在C-2中心的构型反转如发现用于脂肪酸生物合成（参见下文）[24]。然而，试图通过乙基[2-供给到照亮剩余中心的原点2 ħ 2，2- 13 C] -琥珀酸酯产生标记（2 - [R） - 甲基丙二酰辅酶A原位，尚无定论。

获得作为纯蛋白质的红霉素PKS（DEBS）多酶[25]允许在体外更受控制的条件下研究顺式 -AT PKS中的延伸单元偏好。关键的是，研究人员能够通过在旨在最大限度减少自发差向异构化的条件下酶促去除对映体底物，仅产生14 C-（2 S） - 或（2 R） - 甲基丙二酰-CoA（分别为7和8）。使用得到的对映体材料，然后通过放射自显影显示所有六种DEBS蛋白的酰化对（2S） - 异构体（7）具有高度特异性[26]。，暗示多酶中存在的六个AT结构域仅选择该立体异构体（图5）。

随后用模型重组蛋白DEBS 1-TE（图6）进行的体外研究证实，这种偏好也在链扩展期间进行[27]。DEBS 1-TE蛋白是通过将末端TE结构域连接到双模第一亚基DEBS 1 [28]的末端而产生的，以在三酮化合物阶段引起聚酮化合物的释放。该修饰导致实验上易处理的δ-内酯9而不是14-元大环内酯，6-脱氧红霉内酯B.值得注意的是，内酯中的两个甲基中心具有相反的构型（为清楚起见，在C-2处将被称为D-构型，而在C-4处被称为D-构型为L），因此DEBS 1-TE代表了用于阐明两种配置的起源的理想系统。在一个合适的起始单元的存在，如丙酰辅酶A，（2 - [R ）-甲基CoA作为延长器单元和NADPH（辅因子为KR结构域），没有观察到产物。但是，当代替提供（2S） - 甲基丙二酰基-CoA时，以令人满意的速率获得产物，表明两个组件都选择该异构体。因此，认为其中一种甲基构型是由于使用（2R现在牢固地排除了分析的模块中的甲基丙二酰基-CoA和使用（2S） - 异构体的第二种 - 甲基丙二酰基-CoA 。鉴于来自顺式 -AT PKS的许多AT结构域之间的高度同源性[29]，所有这些酰基转移酶可能表现出相同的立体特异性。

AT结构域通过乒乓双bi机制[30]起作用，其中最初形成的酰基-O -AT中间体受到ACP结构域的末端磷酸泛酰巯基硫醇的亲核攻击。最近来自DEBS模块3（图3）的AT结构域的稳态动力学分析提供了证据表明（2S） - 甲基丙二酰辅酶A 的特异性在乒乓机制的前半反应期间表达（即，形成甲基丙二酰-O -AT中间体）[30]。基质偏好可以至少部分地通过生物信息学合理化，生物信息学揭示了与构建块选择相关的几个序列基序（无论是起始单元还是扩展单元，丙二酰基或支化扩展单元）[31-37]，结合结构阐明于来自DEBS PKS 的AT 5的高分辨率，其在乙酸盐存在下溶解（图7）[38]。

例如，增量剂单位特异性AT在活性位点（R667和H745，DEBS AT 5编号）中含有带正电荷的残基，能够与结构单元的羧基形成盐桥，而这些是起始物中的非极性氨基酸。 -unit特定的AT。甲基丙二酰辅酶A相对于丙二酰辅酶A的选择与活性位点丝氨酸下游约100个残基的YASH基序相关，而丙二酰辅酶A特异性AT显示另一种HAFH序列（图7a）[38]。在AT 5中晶体结构，Tyr，Ser和His都位于活性位点内（His是催化二元组的第二个成员）。这导致了一种模型，其中甲基丙二酰基-CoA的C-2-甲基与Tyr形成有利的疏水相互作用，同时由相对小的Ser空间地容纳（图7b）。最后，立体特异性的（2 小号） -异构体似乎在于，将一个（2之间发生空间碰撞- [R ）-甲基组并且两个丝氨酸的YASH基序的His和。尽管如此，通过交换这些关键序列基序，体内将甲基丙二酰辅酶A特异性AT转化为丙二酰辅酶A特异性AT的努力仅导致能够识别两个扩展单元的混杂AT [32,34,36]，揭示AT活性位点的其他元素有助于特异性。

就较不常见的增长剂单元的立体化学而言，标记研究表明，乙基丙二酰辅酶A 的（2S）异构体也被使用[39]，这与其主要来源于巴豆酰辅酶A的还原羧化有关[40]。。几种增链剂单元，包括氨基丙二酰-ACP [41]和羟基 - /甲氧基丙二酰-ACP [42]通过来自初级代谢物的多步途径产生，中间体拴系到离散的ACP结构域。然后将构建块转移到PKS的AT域，并从那里转移到下游的整体ACP以参与链延伸。基于推测的这些增长剂单元的生物合成来源（分别来自L-丝氨酸和来自糖酵解中间体（很可能是1,3-二磷酸-D-甘油酸酯）），最初提出了（2S） - 异构体aminomalonyl-ACP和（2 - [R）羟基/ methoxymalonyl-ACP的异构体[39]采用。然而，更近期关于zwittermicin途径的晶体学研究[43]其中羟基丙二酰基-ACP用作增量剂单元，对羟基丙二酰基立体化学提出了一些不确定性，因为（2S） - 异构体似乎更适合所研究的AT结构。实际上，（2选择小号） -异构体，相应地，（2 - [R）aminomalonyl-ACP的异构体，将简化的生物合成机制在许多聚酮化合物途径，因为所得挂件中心的差向异构化之后（参见下文）不需要。