酮还原酶

KR结构域催化由链延长反应产生的C-3-酮基的立体特异性还原，得到所得羟基的两种可能的立体异构体。减少的方向是KR结构域固有的，因为大多数通过基因工程移植到替代背景中的KR都保持了其原生的立体特异性[49-51]。酶法生成的，手性氘NADPH孵育（两者（4 - [R ）-和（4 小号） - [4- 2 H] NADPH）与通过从DEBS PKS所得产物的模块1,2，5和6和分析GC-MS显示所有的KR都特异于烟酰胺辅助因子的4'- pro - S氢化物[52,53]，如脂肪酸生物合成[54,55]。鉴于来自模块化PKS系统的KR之间的高序列相似性，这种氢化物特异性可能对所有这些都是共同的。实际上，到目前为止解决的8个KR结构（7个来自顺式 -AT PKS [56-62]，1个来自反式 -AT PKS [63]）显示这些结构域采用相同的整体折叠并共享保守的活性位点结构。这些分析揭示了KRs是含有催化亚结构域和催化失活结构亚结构域的单体蛋白质，两者都表现出Rossmann折叠。在催化子域内，所有还原酶活性KR都具有Tyr，Ser，Lys和Asn的活性位点四分体[64]短链脱氢酶/还原酶（SDR）超家族的特征[65,66]，并以相同的方向结合NADPH辅因子，使其向活性位点呈现其4'- pro - S氢化物。因此，酮还原的替代方向（称为A-和B-型[67]以避免模糊，因为R / S指定可以根据官能团的相对优先级而变化）被认为是由相反的模式产生的。绑定到公共活动中心（即，绑定模式通过围绕目标羰基轴旋转180°相关，与re或si相关联面向C-3-keto组呈现给NADPH）（图11）。

实现这些替代的结合模式需要基板在适当时从KR的一侧或另一侧进入。几个序列基序（此处称为'Caffrey基序'）与还原方向相关并因此可能引导底物进入，最初通过比较序列分析[64,67]确定，随后通过结构分析显示占据近端位置到活跃网站[56-62]。B型KR结构域的最强指示是在氨基酸88和103之间的区域中的LDD基序（编号如[67]），其在A型KR结构域中不存在（反式 -AT中的B型KR结构域）PKS似乎只是为了保存第二个D [63]）。这些残留物位于与活性位点相邻的柔性环（“盖环”）上。134-149区域中的其他氨基酸，特别是P144和N148，与B型KRs相关，而W141位于与LDD基序结合的底物的相对侧，最强烈地表示A型KR。尽管如此，尽管存在多种酮还原酶结构，但这些残基在将底物引导至其正确方向中的作用仍不清楚，可能是因为没有一种KR与天然聚酮化合物中间体和辅因子共同结晶为三元复合物。

迄今为止，已经提出了两种替代机制来解释基板定位。在第一个[57]中，“东南”入口（A型还原）是默认的，并且从这个方向，ACP的磷酸泛酰巯基乙胺臂可以接触保守的W.在B型KR中，另一方面，东南部LDD和'盖螺旋'（与NADPH辅助因子相邻的移动α-螺旋）之间的相互作用阻断了活性位点的一侧，这阻止了磷酸泛酰巯基胺臂在它们之间滑动。因此，中间体从“西北”侧进入活性位点，其中磷酸泛酰巯基乙胺可以与保守的Leu形成有利的相互作用。在备选提案[62]，减少的方向由A-和B-型域的活性位点内的不同排序程度控制。在A型KRs中，辅因子结合产生组织良好且易催化的活性位点，其中有一个关键残基（Met在解析结构中，机制所基于[62]阻止从西北方向进入，允许基板仅从东南方向穿透活动部位凹槽。这种类型的KR的特征W指向东南入口通道，其中它可以通过氢键帮助定向磷酸泛酰巯基乙胺辅助因子。相反，在B型KR中，辅因子结合是松散的，原则上允许聚酮化合物从通道的两侧进入。然而，仅从西北侧结合底物导致活性位点的催化能力构象。在该模型中，LDD基序不直接与底物相互作用，但可能有助于底物辅助的活性位点组装。（有关基板引导的最新想法，请参见[69]）。

虽然KRs在其原生环境中催化从一个方向或另一个方向减少，但对于许多KR而言，这种严格的控制至少部分地在体外丧失。已经使用模型合成底物在天然和工程化模块[48,70,71]的背景下进行KR活性的测定，并且获得KR 作为分离的结构域[58,61-63,68,72-76]。在大多数情况下，使用的底物是合成可接近的（2 RS）-2-甲基-3-氧代戊酸N-乙酰基半胱胺（NAC）硫酯（'β-酮二酮）17 - 生成的二酮的外消旋类似物通过丙酰基起始单元和（2S） - 甲基丙二酰基增长剂单元。选择NAC作为活化基团，因为它模拟磷酸泛酰巯基因辅因子的末端部分，其中链延伸中间体通常被束缚。还原产物的立体化学通常通过GC-MS建立并与真实的合成标准比较，或者通过LC-MS进行比较。使用来自DEBS [68]，泰乐菌素（Tyl）[68,72]和两性霉素[ 58,61 ] PKS 的KRs获得的结果分析（图12）），表明当KRs在C-2甲基位置选择正确的立体异构体时，几乎只在原始方向上发生还原; 对于某些具有在ACP结构域上原位酶促产生的二酮化合物和三酮化合物中间体的这些KR获得了相同的结果[77]，该过程仅产生正确的C-2甲基异构体（参见下文）。然而，当选择和减少不正确的甲基异构体时（在某些情况下是动力学上有利的结果[68]），在原生和反向都发生了减少（图12））。因此，在这些情况下，甲基立体化学的变化足以翻转活性位点中的底物，表明两种结合模式之间的能量差异很小。（具有这些结果的警告是，如果底物与天然底物更接近和/或底物附着于ACP结构域，即使存在'错误的'甲基立体化学，还原可能仍然遵循自然过程（结果）例如，未将（2 RS）-2-甲基-3-氧代戊酸酯束缚在ACP上，尚未测试））。在任何情况下，这些数据都鼓励了这样的观点，即KR活性位点中的一些关键残基的突变可能用于改变还原立体化学。

定点诱变确实可以改变酮还原的立体化学结果，至少在体外，表明改变的残基确实在立体控制中起一定作用。特别是引入两个Caffrey图案的变化就是这种情况。例如，将DEBS KR 1的B型基序交换为特征性A型残基，得到KR，其仅催化β-酮二酮的A型还原17 [73]。然而，出乎意料的是，用A型DEBS KR 2进行反向变化产生了具有增加的对模型底物的野生型行为的突变体KR，因此靶向残基不能是酮还原方向的唯一决定因素。类似地，Caffrey基序的高通量诱变[74]和通过序列和/或结构分析确定可能参与立体控制的其他残基[58,61]，未能产生一致的结果，某些突变导致预测的立体化学转变，其他则再次加强野生型行为，以及还有一些对立体化学结果没有影响。最重要的是，将相同的Caffrey基序突变引入DEBS 1-TE中的DEBS KRs 1和2中，在体内没有产生可辨别的立体化学转换[78]。。这些结果清楚地表明，在完整的PKS多酶的背景下，其他因素超越了这些突变的影响; 可能性包括一个或多个下游结构域对立体化学改变的中间体起作用的特异性，通过簇相关TEII结构域的校对活性增加水解去除失效链[79-81]，或者由于事实上，中间体被连接到ACP结构域，ACP结构域本身与KR共价连接; 如果这些机制中的任何一个占主导地位仍有待确定。与此同时，已证明在PKS多酶体内和之间交换整个KR结构域更为成功，作为实现C-3-羟基立体化学基本原理改变的手段[49-51]。

如前所述，在某些模块中的链延长之后，初始D-2-甲基经历差向异构化反应以产生L-甲基。在机理术语中，差向异构化包括去除C-2质子并将质子从所得的平面烯醇/烯醇化物中间体的相对面输送到C-2。通过NMR监测模型C-3-酮酰基酯（2-甲基乙酰乙酸乙酯）的差向异构化速率表明该反应在室温下快速（t 1/2 = 4.7分钟）[82]。因此，在聚酮化合物生物合成期间，必须有一些机制来保护中间体免于链扩展后的自发差向异构化，因为它在酮还原之前在KS和KR活性位点之间以及KR内传递（在所有方法中发生差向异构化的替代可能性）模块但KRs选择正确的异构体被DEBS 1-TE的体外研究排除（图9）[46]，因为氘代增长剂单元中的氘不会保留在三酮内酯产物中。已经提出通过ACP结构域螯合中间体作为C-2的构型稳定性来源[82]。。然而，由于迄今为止通过NMR对该问题的所有直接研究未能揭示模块化PKS ACP结构域与其附着的底物之间的任何直接接触[83-85]，这种稳定化的起源仍然未知。

首先建议KR作为差向异构酶 - 尽管事实上没有其他SDR酶表现出这种活性 - 基于结构分析[57]。该提议导致将在C-2甲基化底物上工作的PKS KR分为六个不同的类别 - KRs在没有差向异构化的情况下催化A-和B-型还原（分别为A1和B1），KRs催化差向异构化和两者酮还原（A2和B2），还原和差向异构化非活性KRs（C1）的感觉，以及在没有还原的情况下催化差向异构化的KRs（C2）。（在缺乏C-2甲基的底物上操作的KR被称为A0和B0）。该活动的第一个直接证据是通过重组模块的研究（单独纯化的KS-AT didomains，ACPs和KRs的组合）提供的[77]。简而言之，这项工作的显着发现是，产品的C-2和C-3的立体化学结果与KS-AT和ACP结构域的模块起源不相关，而与KR的结构相关。例如，在起始单元（合成丙酰-SNAC），NADPH存在下，将来自DEBS模块6（其产生非差向异构化甲基和A-型C-3-羟基）的KS-AT和ACP与DEBS KR 1组合。 （12）和（2 RS） - 甲基丙二酰基-CoA，在与模块1相关的C-2甲基（差向异构化）和C-3-羟基（B-型）上产生具有立体化学的二酮化合物（图13））。相反，将来自DEBS模块1的KS-AT和ACP结构域（其产生差向异构化的甲基和B-型C-3羟基）与DEBS模块6KK混合，得到结合了模块6的立体化学特征的二酮化合物（未稠化的C- C-3处的2甲基和A-型还原（图13）。因此，这些实验提供了第一个确凿的证据，即某些KR结构域可以控制链延伸中间体的C-2和C-3的立体化学。

最令人信服的证据来自一系列所谓的“平衡同位素交换（EIX）”实验[86-88] - 另一个清晰的说明化学能力来阐明立体控制的关键方面。在这些测定中（图14a），选择的KR（DEBS KR 1，制霉菌素（Nys）KR 1和利福霉素（Rif）KR 7）的差向异构化活性通过将它们与立体化学合适的，构型稳定的还原产物一起温育直接证实。化学合成，其中C-2是氘标记的（即，[2- 2H] -2-甲基-3-羟基戊酸）; 将底物酶促连接至源自DEBS PKS的模型ACP结构域。通过与NADP +一起温育，氧化还原反应反向进行，在氧化的（（2R） - 或（2S）-2-甲基-3-酮酰基-ACP）和还原形式之间建立平衡。在这些条件下，对于差向异构体KRs，氘从C-2位置（背景上方）的时间依赖性冲洗发生，因为一旦存在C-3-酮，它们能够外消旋化该位置，而标记对于两个模型保持完整。通过LC-MS分析证实，非差向异构体KRs（DEBS KR 6和Tyl KR 1）[89]还原产物（使用手性GC-MS确认还原产物的构型没有变化）。